GPR40在INS-1細(xì)胞胰島素分泌和脂性凋亡中的作用.pdf

1、目的: G蛋白偶聯(lián)受體40（GPR40）是表達(dá)于β細(xì)胞的特異性游離脂肪酸（FFA）受體，介導(dǎo)FFA對β細(xì)胞胰島素分泌功能的調(diào)節(jié)。本研究觀察不同濃度的葡萄糖和棕櫚酸（PA）作用不同時(shí)間對胰島素分泌功能和胰島素、GPR40基因表達(dá)的影響；觀察不同濃度的葡萄糖和PA對細(xì)胞活性和細(xì)胞凋亡的影響；抑制或增強(qiáng)GPR40的表達(dá)，觀察PA對β細(xì)胞胰島素分泌功能、胰島素基因表達(dá)和細(xì)胞活性、凋亡的影響，探討GPR40在β細(xì)胞功能及脂性凋亡中的作用；并通過對

2、活性氧和胰島素信號途徑胰島素受體底物（IRS）和蛋白激酶B(PKB)磷酸化的檢測進(jìn)一步研究脂毒性誘導(dǎo)β細(xì)胞功能障礙及脂性凋亡的分子機(jī)制。 方法: 利用siRNA和質(zhì)粒轉(zhuǎn)染技術(shù)，抑制或增強(qiáng)GPR40的表達(dá)，在不同糖濃度下用PA培養(yǎng)24-48h，RT-PCR方法檢測胰島素和GPR40基因的表達(dá)，放射免疫法檢測胰島素分泌的變化，流式細(xì)胞術(shù)和免疫熒光方法檢測細(xì)胞凋亡的變化，酶標(biāo)法測定活性氧的表達(dá)，western blot檢測IRS、PK

3、B磷酸化水平的變化。 結(jié)果: 一、不同濃度葡萄糖及PA對INS-1細(xì)胞胰島素分泌的影響：以5.6mmol/L葡萄糖（5.6mG）細(xì)胞培養(yǎng)24h作為基礎(chǔ)對照組，與基礎(chǔ)對照組相比，5.6mG培養(yǎng)48h 對基礎(chǔ)狀態(tài)胰島素分泌和葡萄糖刺激的胰島素分泌（GSIS）均無明顯影響，而16.7mmol/L葡萄糖(16.7mG)、33.3mmol/L葡萄糖(33.3mG)培養(yǎng)24小時(shí)后，基礎(chǔ)狀態(tài)下胰島素分泌沒有顯著變化，但GSIS顯著下降

4、，分別較5.6mG對照組下降23.9％、28.5％(P<0.01)。16.7mG、33.3mG 培養(yǎng)48小時(shí)后，基礎(chǔ)狀態(tài)下胰島素分泌分別較對照組下降10％（P>0.05）和11％（P>0.05），差異無顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但GSIS下降更明顯，分別比對照組降低30％和34％（P<0.01）。在5.6mG和33.3mG濃度條件下加入PA孵育48h作為慢性刺激，與5.6mG基礎(chǔ)對照組相比，GSIS 在5.6mG＋PA、33.3mG＋PA組分別減

5、少了13％（P>0.05）和44％（P<0.01）；與相應(yīng)的33.3mG無PA組相比，33.3mG+PA組GSIS下降20％(P<0.05)。這說明在高糖條件下，高濃度游離脂肪酸對葡萄糖刺激的胰島素分泌的抑制作用更加顯著。 二、不同濃度的葡萄糖、PA對胰島素mRNA表達(dá)的影響：葡萄糖對INS-1細(xì)胞胰島素表達(dá)的影響與葡萄糖濃度和作用時(shí)間有關(guān)。以5.6mG培養(yǎng)24h 作為基礎(chǔ)對照組，與基礎(chǔ)對照組相比，5.6mG培養(yǎng)48h 胰島素m

6、RNA的表達(dá)變化無顯著性。隨著葡萄糖濃度的進(jìn)一步升高，胰島素mRNA的表達(dá)量逐漸下降。與對照組相比，16.7mG和33.3mG培養(yǎng)24小時(shí)，胰島素mRNA表達(dá)分別下降22.3％和30.5％(P<0.01)；培養(yǎng)48小時(shí)后，16.7mG和33.3mG培養(yǎng)組胰島素mRNA表達(dá)進(jìn)一步降低，較5.6mG對照組分別下降36％與50％(P<0.01)。5.6mG條件下加入PA培養(yǎng)48h，胰島素mRNA表達(dá)無明顯變化；在33.3mG條件下加入PA培養(yǎng)

7、48h，胰島素mRNA較5.6mG對照組下降78％（P<0.01），與相應(yīng)的33.3mG無PA組比較下降56％（P<0.05）。 三、不同濃度葡萄糖和PA對GPR40基因表達(dá)的影響：不同濃度的葡萄糖（5.6mmol/L、16.7mmol/L和33.3mmol/L）培養(yǎng)24h和48h對GPR40表達(dá)沒有明顯影響。在5.6mG濃度條件下加入PA培養(yǎng)24、48h，GPR40表達(dá)較正常對照組無顯著差異；在33.3mG濃度條件下加入PA培

8、養(yǎng)24小時(shí)后與5.6mG對照組相比，GPR40mRNA表達(dá)增加12％（P>0.05），但繼續(xù)培養(yǎng)至48h時(shí)，GPR40mRNA表達(dá)總量下降40％（P<0.01）。 四、改變GPR40表達(dá)對胰島素分泌和胰島素基因表達(dá)的影響：與GPR40未干預(yù)組相比，細(xì)胞以33.3 mG+PA培養(yǎng)48h，GPR40 pIRESpuro轉(zhuǎn)染組增強(qiáng)GPR40的表達(dá)后GSIS較對照組下降12％(P<0.05)，而siRNA轉(zhuǎn)染組抑制GPR40的表達(dá)后高糖

9、高脂對GSIS的抑制效應(yīng)有了逆轉(zhuǎn)，與未轉(zhuǎn)染組細(xì)胞相比，GSIS增加了20％(P<0.05)。說明GPR40 參與了PA對胰島素分泌的長期影響。長期處于高濃度PA狀態(tài)，GPR40 過度激活可能增加PA對β細(xì)胞胰島素分泌的抑制作用，損害β細(xì)胞的胰島素分泌功能，而抑制GPR40的表達(dá)，可以減輕或逆轉(zhuǎn)高脂對GSIS的抑制。siRNA轉(zhuǎn)染組、GPR40-pIRESpuro轉(zhuǎn)染組在5.6mG、33.3mG濃度條件下加入PA培養(yǎng)48h，與相對應(yīng)的未轉(zhuǎn)

10、染組相比，兩種轉(zhuǎn)染細(xì)胞無論增強(qiáng)還是抑制GPR40表達(dá)，PA在5.6mG和33.3mG條件下引起的胰島素mRNA表達(dá)變化未見顯著性差異。 五、改變GPR40對細(xì)胞活性和凋亡的影響：細(xì)胞在不同糖濃度條件下（5.6mmol/L和33.3mmol/L）用含有或不含有0.5mmol/L的PA處理48小時(shí)，結(jié)果顯示,與5.6mG培養(yǎng)組相比，33.3mG培養(yǎng)48h，細(xì)胞活性顯著降低（P<0.05）。加入0.5mmol/L PA處理48h后，5

11、.6mG和33.3mG組INS-1細(xì)胞的活性均明顯下降（P<0.05），而33.3mG+PA組細(xì)胞活性最低，說明高糖高脂兩者存在時(shí)毒性更大(P<0.05)。siRNA和GPR40-pIRESpuro轉(zhuǎn)染組33.3mG+PA培養(yǎng)48h，與相應(yīng)條件的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比細(xì)胞活性沒有明顯的差異，說明GPR40在體外不參與PA對INS-1細(xì)胞活性的影響。分別在5.6mG和33.3mG條件下加入或不加入PA培養(yǎng)48小時(shí)觀察細(xì)胞的凋亡率。5.6mG培養(yǎng)4

12、8h，細(xì)胞凋亡率為7.9％，33.3 mG培養(yǎng)48h后凋亡率為10.8％(P<0.05）。加入PA培養(yǎng)48h以后，5.6mG和33.3mG組凋亡比例均較無PA組顯著增加，在33.3mG組尤其明顯，凋亡率分別為13.2％和24.9％（P<0.01）。siRNA轉(zhuǎn)染組PA培養(yǎng)48h后凋亡率較無PA細(xì)胞組亦明顯增加，在5.6mG和33.3mG條件下分別為11.9％和22.8％，與相應(yīng)的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞組相比沒有顯著性差異。而GPR40-pIRES

13、puro轉(zhuǎn)染細(xì)胞PA培養(yǎng)48h以后33.3mG條件下細(xì)胞凋亡較相應(yīng)的未轉(zhuǎn)染細(xì)胞增加13％（P>0.05）。 六、活性氧水平的監(jiān)測：與5.6mG培養(yǎng)48小時(shí)相比，33mG高糖培養(yǎng)48h可以顯著增加細(xì)胞內(nèi)活性的水平（P<0.01）。加入PA培養(yǎng)48h，進(jìn)一步增加細(xì)胞內(nèi)活性氧的水平，加入PA后在5.6mG和33.3mG條件下分別較對相應(yīng)糖濃度組增加20％(P<0.05)和15％（P<0.05）。siRNA轉(zhuǎn)染和GPR40-pIRESp

14、uro轉(zhuǎn)染組細(xì)胞33.3mG+PA 中培養(yǎng)48小時(shí)活性氧水平較5.6mG對照組增加46％和56％（P<0.01），但與相同條件下未轉(zhuǎn)染細(xì)胞相比差異無顯著性(P>0.05)。 七：PA對細(xì)胞IRS、PKB 磷酸水平的影響：PA培養(yǎng)可以增加IRS絲氨酸磷酸化水平，抑制PKB的磷酸化；siRNA轉(zhuǎn)染抑制GPR40的表達(dá)，可以降低PA誘導(dǎo)的IRS絲氨酸磷酸化和增加PKB磷酸化；GPR40-pIRESpuro轉(zhuǎn)染增強(qiáng)GPR40的表達(dá)，與相