兒童特應(yīng)性皮炎體液中microRNAs表達(dá)的相關(guān)性研究.pdf

1、前言
　　特應(yīng)性皮炎(atopicdermatitis，AD)，是一種較為常見(jiàn)的慢性炎癥性皮膚疾病。特應(yīng)性皮炎的病因與發(fā)病機(jī)制還不是很清楚，目前的研究認(rèn)為可能是遺傳因素，免疫因素與環(huán)境因素相互作用并通過(guò)免疫途徑介導(dǎo)產(chǎn)生的結(jié)果。特應(yīng)性皮炎多數(shù)在嬰幼兒發(fā)病，典型分部的皮損和嚴(yán)重的瘙癢為本病的主要臨床特點(diǎn)。
　　特應(yīng)性皮炎的臨床診斷主要依靠患者的病史和臨床表現(xiàn)，目前常用的國(guó)際診斷標(biāo)準(zhǔn)為Hanifin和Rajka制定的診斷標(biāo)準(zhǔn)和Wi

2、llams診斷標(biāo)準(zhǔn)。SCORAD評(píng)分被用來(lái)評(píng)估疾病臨床的嚴(yán)重程度。但SCORAD評(píng)分具有一定的主觀性，主要依靠患者和醫(yī)生的主觀印象，因此在臨床調(diào)查研究中，常需要兩名皮膚科醫(yī)生對(duì)患者進(jìn)行評(píng)估。特應(yīng)性皮炎患者的實(shí)驗(yàn)室檢查無(wú)特異性，大多數(shù)患者的IgE水平和嗜酸性粒細(xì)胞均有不同程度的升高。研究證明，對(duì)AD兒童外用含有神經(jīng)酰胺的保濕乳液，可以恢復(fù)患兒的皮膚屏障功能，緩解瘙癢。早期合理的防護(hù)可以增加皮膚含水量并維持皮膚屏障功能在最佳生理水平的最有效

3、方法之一。因此，對(duì)于AD的早期診斷，并給予皮膚的保濕防護(hù)，可以有效控制疾病的發(fā)展，改善臨床癥狀，提高患兒的生活質(zhì)量。
　　MiRNAs（microRNAs）是一類(lèi)長(zhǎng)度約為22-25nt大小的非編碼RNA分子，由一段具有莖環(huán)結(jié)構(gòu)的長(zhǎng)度為70～80nt的單鏈RNA前體(pre-miRNA)剪切后生成。miRNAs通過(guò)RISC(RNA-inducedsilencingcomplex)復(fù)合體和靶mRNA互補(bǔ)結(jié)合，抑制蛋白表達(dá)或促進(jìn)蛋白降解

4、。研究表明，miRNAs參與基因表達(dá)、細(xì)胞周期調(diào)控、和個(gè)體發(fā)育等多方面調(diào)控，而且，miRNAs在很多疾病中也有異常表達(dá)。miRNAs的異常表達(dá)和突變最多見(jiàn)于與腫瘤的發(fā)病有關(guān)。目前越來(lái)越多的研究表明，miRNAs和炎癥性疾病如銀屑病，和哮喘具有一定的相關(guān)性。而且，miRNAs在皮膚中的表達(dá)具有特征性，如miRNA-200家族（如miRNA-200a、miRNA-200b、miRNA-200c、miRNA-141和miRNA-149），和m

5、iRNA-19、miRNA-20家族（如miRNA-19b、miRNA-20、miRNA-17-5p和miRNA-93）在表皮中優(yōu)先表達(dá)，而miRNA-199家族(如miRNA-199a和miRNA-199b)僅在毛囊中表達(dá)。miRNA-203是皮膚特異性miRNAs，在皮膚中高水平表達(dá)，和表皮分化有關(guān)。這些研究表明miRNAs與皮膚疾病之間有著密不可分的關(guān)聯(lián)。
　　miRNAs在特應(yīng)性疾病的發(fā)病中也起著重要的作用。miR-155

6、在AD患者的皮損處皮膚表達(dá)升高，其主要作用是增加了T細(xì)胞的增殖性應(yīng)答引發(fā)皮膚慢性炎癥。這一過(guò)程是通過(guò)抑制CTLA-4來(lái)實(shí)現(xiàn)的，CTLA-4是T細(xì)胞活化的主要抑制劑，同時(shí)，CTLA-4也是miR-155的靶基因，AD患者的皮損處皮膚miR-155表達(dá)升高，抑制了CTLA-4的活性，因此，T細(xì)胞活化增強(qiáng)，T細(xì)胞的反應(yīng)增殖性增強(qiáng)，引發(fā)皮膚慢性炎癥。哮喘是AD的常見(jiàn)伴隨癥狀，miR-126與哮喘的發(fā)病有關(guān)。miR-126表達(dá)升高可以誘發(fā)哮喘，抑

7、制miR-126可以抑制IL-4介導(dǎo)的呼吸道炎癥，從而抑制Th2介導(dǎo)的過(guò)敏性哮喘。
　　人體各種組織中均有miRNAs的表達(dá)，如肝臟、心臟、肺等，而且，miRNAs在不同組織器官中的表達(dá)變化，對(duì)疾病的潛在信息有重要意義。miRNAs不僅在各種組織中穩(wěn)定的表達(dá)，在血清中也有相當(dāng)?shù)臄?shù)量的miRNAs存在，而且其表達(dá)相當(dāng)穩(wěn)定。通過(guò)測(cè)序?qū)ρ逯兄饕男『怂崞芜M(jìn)行測(cè)序分析可以清晰的鑒別出miRNAs和其他小RNA，如rRNAs，或者降解的

8、RNA片段，分析顯示血清中存在有相當(dāng)數(shù)量的不同來(lái)源的小RNA，長(zhǎng)度在21-23nt，和miRNAs的長(zhǎng)度一致。研究表明血清中的小RNA片段中包含豐富的miRNA，而且正常人的血清和血細(xì)胞中miRNAs的表達(dá)基本一致，和來(lái)自相同個(gè)體的血細(xì)胞比較，血清含有一個(gè)相對(duì)低水平的miRNA。且研究指出miRNAs不易被RNA酶裂解，是穩(wěn)定存在的。在經(jīng)過(guò)各種苛刻的條件處理后，包括煮沸，過(guò)于酸性或過(guò)于堿性，長(zhǎng)時(shí)間儲(chǔ)存，多次凍融等，血清miRNAs的穩(wěn)定

9、性尚好。RT-PCR分析，未經(jīng)過(guò)任何處理的血清miRNA與經(jīng)過(guò)各種苛刻條件處理后的血清miRNAs無(wú)顯著性差異。大部分的miRNA在男性和女性受試者中的表達(dá)水平?jīng)]有明顯差異。至于血清中miRNAs的來(lái)源目前還不是很清楚。在疾病過(guò)程中，血清miRNA不僅來(lái)源于血細(xì)胞循環(huán)，也來(lái)源于其他受疾病影響的組織。因此，基于miRNAs的這些特性，這些與疾病相關(guān)的異常表達(dá)的特異性血清miRNA可以作為疾病潛在的生物標(biāo)識(shí)物。除了血清，miRNAs也穩(wěn)定存

10、在于其他的體液中，如尿液、眼淚、羊水等。miRNA與特應(yīng)性疾病的相關(guān)性研究尚少，尤其是體液miRNA在兒童AD患者中的表達(dá)情況目前國(guó)內(nèi)尚無(wú)這方面的研究報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)主要擬研究miRNA在中國(guó)兒童AD患者體液中的表達(dá)情況，以探討特異性miRNA在AD發(fā)病過(guò)程可能介導(dǎo)的發(fā)病機(jī)制，為兒童AD的診斷尋找新的生物標(biāo)識(shí)物。
　　材料和方法
　　一、研究對(duì)象
　　1、實(shí)驗(yàn)組兒童AD患者30例，均符合Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)。男22例，

11、女8例，年齡范圍在6個(gè)月至6歲，平均年齡1.9±0.32歲。入選患者均為中國(guó)漢族，均處于疾病的急性期，并采用SCORAD評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)評(píng)估疾病的嚴(yán)重程度。所有患者就診前3個(gè)月未接收系統(tǒng)性糖皮質(zhì)激素治療，及其他免疫抑制劑治療。
　　2、對(duì)照組兒童28例，來(lái)自?xún)和饪频幕颊?，受試者主要為血管瘤，隱睪等非系統(tǒng)性疾病，無(wú)濕疹病史。男24例，女4例，年齡范圍在6個(gè)月至6歲，平均年齡2.1±0.16歲。所有入選受試者均為中國(guó)漢族，血清IgE水平均處于

12、正常水平，均排除過(guò)敏性鼻炎、哮喘等過(guò)敏性疾病及其他系統(tǒng)性疾病。
　　樣品處理:每個(gè)受試者收集外周血2ml，尿液5ml，2小時(shí)內(nèi)以2500g/min離心10分鐘。分離血清及血細(xì)胞，尿液上清及尿沉渣。血清和尿液上清分裝置于-80℃深凍冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　實(shí)驗(yàn)組及對(duì)照組所有受試者年齡、性別均具有可比性，并已排除精神、神經(jīng)系統(tǒng)疾患，并告知其家屬，由家長(zhǎng)簽訂知情同意書(shū)。
　　二、實(shí)驗(yàn)材料
　　氯仿、無(wú)水乙醇、Qiagenm

13、iRNeasyMinikit、ABI公司TaqManMiRNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒、MegaplexRT引物、MultiScribe反轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、PreAmpMasterMix、PreAmp引物、蒸餾水、TE液、enzyme-linkedimmunosorbentassay(ELISA)kit、RayBio(R)HumanCytokineAntibodyArraysV&5.1。
　　三、實(shí)驗(yàn)方法
　　1、應(yīng)用TaqMan

14、低密度芯片(TaqManLowDensityArray(TLDA)HumanmicroRNAPanelversion1.0)實(shí)驗(yàn)方法，尋找差異性表達(dá)miRNAs。
　　2、應(yīng)用Real-timePCR方法對(duì)芯片鑒定的差異性表達(dá)miRNAs進(jìn)行驗(yàn)證。
　　3、應(yīng)用ELISA方法檢測(cè)SOCS3和STAT3在血清中的表達(dá)情況。
　　4、應(yīng)用蛋白抗體芯片(RayBio(R)HumanCytokineAntibodyArrays

15、V&5.1)實(shí)驗(yàn)方法，鑒定差異性表達(dá)的炎癥因子。
　　四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析
　　統(tǒng)計(jì)方法主要為t檢驗(yàn)、單因素方差分析、Pearson's相關(guān)性研究等，取P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。統(tǒng)計(jì)學(xué)分析軟件為SPSS18.0和GraphPadPrism5Project。
　　結(jié)果
　　1、兒童AD體液中miRNAs的表達(dá)情況
　　(1)所有受試者的血清和尿液中且均檢測(cè)到miRNAs的表達(dá)，miRNAs穩(wěn)定的表達(dá)在兒童的體液中

16、。
　　(2)兒童AD的血清和尿液中miRNAs的表達(dá)都具有特異性，二者均檢測(cè)出差異性表達(dá)的miRNAs。兒童AD血清檢測(cè)到10種差異性表達(dá)的miRNAs，其中9種miRNAs表達(dá)升高，1種miRNAs表達(dá)下降。兒童AD尿液中檢測(cè)出17種差異性表達(dá)的miRNAs，其中10種miRNAs表達(dá)升高，7種miRNAs表達(dá)下降。
　　(3)血清和尿液中miRNAs表達(dá)具有一致性，在兒童AD的血清和尿液中均檢測(cè)到miR-203、miR

17、-483-5p和miR-205的存在。其中miR-203在血清中表達(dá)升高，而在尿液中表達(dá)降低;miR-483-5p和miR-205在血清中表達(dá)升高，在尿液中表達(dá)也是升高的。
　　(4)Real-timePCR驗(yàn)證后得出，和對(duì)照組相比，兒童AD血清中miR-203和miR-483-5p表達(dá)升高，具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miR-483-5p與家族異位史有關(guān)，家族其他人伴有異位史的患者比個(gè)人伴有異位史的患者血清miR-483-5p的表達(dá)升高的更

18、為顯著。miR-203和miR-483-5p的表達(dá)和臨床SCORAD評(píng)分具有正相關(guān)的趨勢(shì)，但P值未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。尿液中miR-203表達(dá)降低且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。miRNAs的表達(dá)和患者的性別年齡無(wú)顯著相關(guān)性。
　　2、SOCS3和STAT3在兒童AD血清中的表達(dá)情況
　　(1)兒童AD的血清SOCS3水平和對(duì)照組相比顯著升高，兒童AD的血清STAT3水平和對(duì)照組相比也顯著升高，且均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　(2)兒童AD的

19、血清SOCS3水平與miR-203和miR-483-5p的表達(dá)具有相反的表達(dá)趨勢(shì)，雖然分析顯示P值未達(dá)到統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但對(duì)臨床具有重大意義。
　　(3)兒童AD的血清STAT3水平和臨床SCORAD評(píng)分成正相關(guān)，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。STAT3和SOCS3無(wú)明顯相關(guān)性。
　　3、兒童AD血清中炎癥相關(guān)蛋白的表達(dá)情況
　　(1)兒童AD血清中MIP-1β、sTNFRI、ICAM-1、sTNFRⅡ和MCP-1水平顯著升高;IL-

20、6sR和TIMP-2水平顯著降低。
　　(2)TIMP-2，sTNFRⅡ和MCP-1，3種炎癥因子和臨床SCORAD評(píng)分成正相關(guān)，sTNFRⅠ和sTNFRⅡ分別與miR-203成正相關(guān)。ICAM-1和SOCS3成負(fù)相關(guān)。
　　(3)兒童AD血清中異常表達(dá)的七種炎癥因子MIP-1β，sTNFRⅠ，ICAM-1，IL-6sR，TIMP-2，sTNFRⅡ和MCP-1在AD的發(fā)病過(guò)程中可能參與了效應(yīng)細(xì)胞凋亡、Th2細(xì)胞應(yīng)答、炎性細(xì)胞

21、浸潤(rùn)，及瘙癢信號(hào)等調(diào)節(jié)作用，并和SOCS3/STAT3通路有關(guān)。
　　結(jié)論
　　1、miRNAs穩(wěn)定的表達(dá)在兒童的體液中，包括血清和尿液。
　　2、兒童AD的血清和尿液中均具有特異性的miRNAs表達(dá)模式。兒童AD血清中miR-203和miR-483-5p表達(dá)升高，尿液中miR-203表達(dá)降低。血清miR-203和miR-483-5p的表達(dá)和疾病的臨床嚴(yán)重程度有一定相關(guān)性。
　　3、兒童AD的血清和尿液在具有各自