β-catenin通過鈉-鉀ATP酶的α2亞單位調(diào)節(jié)骨骼肌細胞的靜息膜電位.pdf

1、目的:
　　β-catenin胞漿蛋白是Wnt經(jīng)典信號通路的一個重要下游分子，它在各系統(tǒng)組織中作用廣泛。β-catenin已經(jīng)被證實在神經(jīng)肌肉接頭(neuromuscular junction，NMJ)形成中起著重要作用。而骨骼肌而并非突觸前神經(jīng)元的β-catenin在NMJ中作用尤為重要。我們之前的研究已經(jīng)表明:特異性地敲除小鼠骨骼肌細胞中的β-catenin(HSA-β-cat-/-)會引起出生后小鼠的早期死亡。目前在關(guān)于骨骼

2、肌β-catenin缺失的研究中，主要認為這與骨骼肌β-catenin影響NMJ發(fā)育相關(guān)，為了更好地理解其中蘊含的機制，我們獲取HSA-β-cat-/-敲除小鼠，檢測其和同窩對照小鼠骨骼肌細胞的電生理差異，并結(jié)合體外用靶向β-catenin的小片段干擾RNAs(β-cateninsiRNAs)轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的小鼠成肌纖維細胞(C2C12)的方法進一步證實這種差異，從而來探討骨骼肌β-catenin缺失后小鼠致死的可能原因和引起RMP去極化的可

3、能機制，并進一步為β-catenin在NMJ發(fā)育中的作用研究提供補充證據(jù)和新的思路。
　　方法:
　　1.實驗分組:1）HSA-β-cat-/-敲除P0小鼠組和同窩β-catloxp/loxpP0小鼠對照組，各4-6只;
　　2)分別轉(zhuǎn)染了β-catenin siRNA259、β-catenin siRNA577、β-catenin siRNA1312的三組C2C12細胞作為實驗組和轉(zhuǎn)染了scrambled siRNA

4、的C2C12細胞作為對照組;
　　2.實驗方法:雜交小鼠獲取敲除組和實驗組小鼠，分別對各組小鼠膈肌、腓腸肌、趾長伸肌進行細胞內(nèi)記錄;轉(zhuǎn)染C2C12細胞，對各組進行全細胞記錄;Westernblot法檢測各組轉(zhuǎn)染后C2C12細胞和各組小鼠肌肉中鈉/鉀ATP酶(Na，K-ATPase)a2亞單位(a2NKA)、Na, K-ATPase的a1亞單位(a1NKA)、Kv3.4蛋白的表達;實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄-PCR檢測兩組小鼠肌肉中a2NK

5、AmRNA的水平。
　　結(jié)果:
　　1.我們發(fā)現(xiàn)敲除組小鼠和對照組小鼠相比，β-catenin的缺失會使膈肌，腓腸肌，趾長伸肌的骨骼肌細胞靜息膜電位(RMP)發(fā)生去極化;
　　2.被轉(zhuǎn)染了β-catenin siRNA的C2C12細胞與對照組細胞相比，RMP同樣發(fā)生了去極化;
　　3.無論是體內(nèi)敲除還是體外敲低骨骼肌細胞的β-catenin都會使鈉a2NKA的表達水平減少，而相應(yīng)細胞中a1NKA和Kv3.4蛋白的