上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化標志物在循環(huán)腫瘤細胞上表達與肝癌轉(zhuǎn)移相關(guān)性研究.pdf

1、目的:
　　本實驗通過檢測肝癌外周血中循環(huán)腫瘤細胞中上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)標志物Twist,Vimentin的表達,同時運用Westernblot和免疫組化方法檢測EMT標志物E-cadherin,Vimentin在原發(fā)性肝癌組織中表達,分析其表達水平與門靜脈癌栓等臨床病理參數(shù)的相關(guān)性,探討循環(huán)腫瘤細胞上EMT標志物的表達水平可作為肝癌轉(zhuǎn)移早期診斷的有效指標的臨床意義,同時對循環(huán)腫瘤細胞在外周血中形成機制研究做初步的探索。

2、　　方法:
　　收集第三軍醫(yī)大學(xué)新橋醫(yī)院肝膽外科2011年11月至2012年11月不同分期肝癌患者外周血標本共40例,收集原發(fā)性肝癌患者術(shù)中肝癌組織及相鄰正常組織標本各30例。采用免疫磁珠分選外周血中循環(huán)腫瘤細胞,免疫熒光鑒定循環(huán)腫瘤細胞及EMT標志物的表達,Westernblot熒光發(fā)光定量檢測Vimentin,E-cadherin在肝癌組織及相鄰正常組織表達,免疫組化化學(xué)法檢測E-cadherin,Vimentin,Twist

3、在肝癌組織及相鄰正常組織表達分布。所有數(shù)據(jù)采用SPSS13.0軟件作統(tǒng)計分析,數(shù)據(jù)統(tǒng)計采用Fisher’s確切概率法,配對t檢驗,Mann-WhitneyU檢驗,spearman等級相關(guān)分析,數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差(x±s)表示,以P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。
　　結(jié)果:
　　1.從40例肝癌患者外周血中成功分選出循環(huán)腫瘤細胞31例,其分選陽性率達77.5％(31/40)。免疫熒光鑒定可發(fā)現(xiàn)循環(huán)腫瘤細胞具有更大的細胞直徑,

4、完整的核仁,較高的核漿比率,同時可有CTCs染色HSA和DAPI陽性,CD45染色陰性。作為對照組中的良性肝病患者、非肝癌腫瘤患者、健康自愿者均未檢出CTCs。
　　2.循環(huán)腫瘤細胞分選的陽性率在門靜脈癌栓的患者中(95.0%)較無門靜脈癌栓的患者(60.0%)明顯增高(P=0.02);CTCs分選的陽性率在Edmondson-Steiner病理分級IIIorIV(91.7%)較病理分級IorII(37.5%;P=0.018)明顯

5、增高;CTCs分選的陽性率在超過Milan標準的患者中為(92.9%),較符合Milan標準的患者(41.7%;P=0.001)顯著增高;CTCs分選的陽性率與腫瘤大小呈明顯的正相關(guān)(r=0.472,P=0.002);CTCs分選的陽性率與腫瘤的TNM分期有明顯的相關(guān)性(r=0.564,P<0.001);然而CTCs分選的陽性率與年齡、性別、病因、肝硬化、腫瘤數(shù)量、肝功能分級和AFP水平無明顯相關(guān)性,差異無統(tǒng)計學(xué)意義。
　　3.在

6、31例循環(huán)腫瘤細胞分選陽性的患者中Twist在CTCs上的表達率為83.8%(26/31),CTCs中Twist的陽性表達率在門靜脈癌栓形成患者中(100.0%)明顯高于無門靜脈癌栓患者(58.3%;P=0.005),然而Twist在CTCs中的表達率與其他臨床病理參數(shù)無明顯相關(guān)性。在31例CTCs分選陽性的患者中Vimentin在CTCs上的表達率為80.6%(25/31),CTCs中Vimentin的陽性表達率與門靜脈癌栓(P=0.

7、022)、Edmondson-Steiner病理分級(P=0.014)、Milan標準(P=0.038)、腫瘤大小(r=0.643,P<0.001)、腫瘤TNM分期(r=0.488,P=0.005)有明顯的相關(guān)性。Twist與Vimentin在CTCs上共表達的陽性率為70.9%(22/31),其共表達陽性率與門靜脈癌栓(P<0.001)、腫瘤大小(r=0.436,P=0.014)、腫瘤TNM分期(r=0.382,P=0.034)有明顯

8、的相關(guān)性,而與其他臨床病理參數(shù)相比較無統(tǒng)計學(xué)差異。
　　4.E-cadherin在肝癌組織中表達的相對定量值為0.082±0.063,較相鄰正常組織表達量0.226±0.215顯著降低(t=-4.050,P<0.001);E-cadherin在有門靜脈癌栓患者的肝癌組織中表達量為0.042±0.032,較無門脈癌栓患者癌組織中表達量0.116±0.063明顯降低(U=34.0,P=0.001);E-cadherin在肝癌TNMⅢ期

9、患者癌組織表達量為0.048±0.034,較肝癌TNMⅠ∕Ⅱ期患者癌組織中表達量0.121±0.067明顯降低(U=41.0,P=0.003);E-cadherin在肝癌組織中的表達與腫瘤病理分級無明顯相關(guān)性(U=99.0,P=0.719)。
　　5.Vimentin在肝癌組織組織中表達的相對定量值為0.638±0.397,較相鄰正常組織表達量0.398±0.282明顯增高(t=3.393,P=0.002);Vimentin在所有

10、肝癌組織中的表達與E-cadherin在肝癌組織中的表達呈明顯的負相關(guān)(r=-0.509,P=0.004);Vimentin在有門靜脈癌栓形成患者肝癌組織中表達量為0.913±0.363,較無門靜脈癌栓患者癌組織表達量0.397±0.239顯著增高(U=24.0,P<0.001)。Vimentin在肝癌TNMⅢ期患者癌組織表達量為0.870±0.359,較TNMⅠ∕Ⅱ期患者表達量0.372±0.245顯著增高(U=25.0,P<0.00

11、1),而Vimentin在肝癌組織中的表達量與其他臨床病理參數(shù)比較無明顯統(tǒng)計學(xué)差異。
　　6.免疫組化檢測肝癌組織及相鄰正常組織鏡下可見E-cadherin在肝癌組織中表達微弱,而相鄰正常組織中呈高表達,其表達主要位于細胞膜;Vimentin在肝癌組織中呈明顯高表達,呈棕黃色顆粒狀位于細胞質(zhì)內(nèi),而在相鄰正常組織中不表達;Twist在肝癌組織中高表達,呈深棕色顆粒位于細胞核和細胞質(zhì)內(nèi),而在相鄰正常組織內(nèi)不表達。
　　結(jié)論:

12、r>　　1.在不同分期的原發(fā)性肝癌患者中,循環(huán)腫瘤細胞分選的陽性率與門靜脈癌栓、腫瘤病理分級、Milan標準、腫瘤大小和腫瘤TNM分期有明顯的相關(guān)性,表明CTCs分選的陽性率可作為預(yù)測肝癌預(yù)后發(fā)展的有效指標。
　　2.表達于循環(huán)腫瘤細胞上的Twist、Viementin的水平與一系列臨床病理參數(shù)相關(guān),但Twist在CTCs陽性表達率、Vimentin在CTCs陽性表達率及Twist和Vimentin在CTCs共表達陽性率與患者門靜

13、脈癌栓顯著相關(guān),說明Twist與Vimentin在CTCs上的表達水平可作為潛在的預(yù)測肝癌轉(zhuǎn)移的早期診斷工具。
　　3.E-cadherin與Vimentin在原發(fā)性肝癌癌組織中表達呈明顯的負相關(guān),表明在原發(fā)性肝癌中發(fā)生了EMT。且隨著腫瘤不斷進展,EMT發(fā)生愈發(fā)明顯,與此同時,CTCs分選的陽性率逐漸升高,Twist與Vimentin在CTCs中的表達水平逐漸增高,這表明EMT可能在促進CTCs形成過程中發(fā)揮重要作用,這為CTC