ORMDL3在哮喘發(fā)生中的作用及其轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制研究.pdf

1、哮喘是一種由環(huán)境和遺傳因素共同作用導(dǎo)致的復(fù)雜疾病，其遺傳率約為36％-79％。2007年，對(duì)哮喘進(jìn)行的第一個(gè)全基因組關(guān)聯(lián)分析發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的哮喘易感基因----ORMDL3。研究者發(fā)現(xiàn)ORMDL3所在的17q21區(qū)域中的遺傳多態(tài)位點(diǎn)與兒童哮喘顯著相關(guān)，并且在EB病毒感染的哮喘兒童的淋巴母細(xì)胞系中，該區(qū)域中的遺傳多態(tài)還與ORMDL3基因的表達(dá)水平密切相關(guān)。
　　 ORMDL3基因位于17q21，是ORM基因家族的一員。在酵母中，該家

2、族含有ORMDL1和ORMDL2兩個(gè)成員，而在人類中還有ORMDL3，共三個(gè)家族成員。在酵母中，該基因家族與神經(jīng)鞘磷脂代謝平衡相關(guān)，是神經(jīng)鞘磷脂合成過(guò)程中第一個(gè)限速酶的負(fù)調(diào)控者，提示神經(jīng)鞘磷脂代謝可能在哮喘的發(fā)生過(guò)程中具有重要作用。另外，在酵母中敲除ORM基因，表現(xiàn)為生長(zhǎng)緩慢和對(duì)有毒物質(zhì)的敏感性增強(qiáng)，這一現(xiàn)象在轉(zhuǎn)染入人類ORMDL3基因的mRNA后得以拯救。ORMDL3基因編碼一個(gè)含有153個(gè)氨基酸的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)四次跨膜蛋白，其在人類組織中表

3、達(dá)廣泛，特別是在肝臟和外周血淋巴細(xì)胞中高表達(dá)。研究表明ORMDL3在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)上與鈣泵共定位，抑制鈣泵的功能，影響鈣離子平衡并且能夠促進(jìn)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激和未折疊蛋白反應(yīng)，表明ORMDL3可能參與內(nèi)質(zhì)網(wǎng)有關(guān)的炎癥反應(yīng)。另外，人們還發(fā)現(xiàn)在兒童臍帶血單核細(xì)胞中17q21區(qū)域中的遺傳多態(tài)不但與ORMDL3，GSDMA基因的表達(dá)水平相關(guān)，而且還與IL-17的分泌相關(guān)，表明該區(qū)域可能在免疫系統(tǒng)成熟的早期階段與T細(xì)胞的發(fā)育分化有關(guān)。而除了與哮喘相關(guān)之外，人們還

4、發(fā)現(xiàn)ORMDL3與克隆恩病、強(qiáng)直性脊柱炎、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、Ⅰ型糖尿病、神經(jīng)膠質(zhì)瘤、原發(fā)性膽汁肝硬化、過(guò)敏性鼻炎等多種炎癥性疾病顯著相關(guān)。
　　 自從發(fā)現(xiàn)ORMDL3是一個(gè)新的哮喘易感基因，在很短的時(shí)間內(nèi)，人們又在多個(gè)不同種族人群中進(jìn)行了驗(yàn)證，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ORMDL3基因在不同人群中均與兒童哮喘顯著相關(guān)。但是所有這些研究都是在兒童哮喘中進(jìn)行的，那么，ORMDL3基因是否也與成人哮喘相關(guān)呢？在EB病毒感染的哮喘兒童淋巴母細(xì)胞系中17q2

5、1上的遺傳多態(tài)與ORMDL3基因的表達(dá)相關(guān)，那么在成人哮喘患者的外周血淋巴細(xì)胞中這一現(xiàn)象是否仍然存在呢？哮喘患者體內(nèi)ORMDL3基因的表達(dá)異常是怎樣引起的呢？ORMDL3基因的表達(dá)調(diào)控又是怎樣的呢？帶著這些問(wèn)題，本論文進(jìn)行了以下四個(gè)方面的研究:
　　 第一部分17q21區(qū)域與中國(guó)漢族成人哮喘的關(guān)聯(lián)分析
　　 為了明確ORMDL3基因所在的17q21區(qū)域與成人哮喘之間的相關(guān)性，我們從山東大學(xué)齊魯醫(yī)院呼吸科收集了710例無(wú)親

6、緣關(guān)系的成人哮喘患者，以及從健康體檢中心隨機(jī)收集了656例無(wú)親緣關(guān)系、無(wú)哮喘病及其它呼吸道疾病及過(guò)敏病史的健康體檢者作為對(duì)照組。根據(jù)相關(guān)報(bào)道及中國(guó)人群中該區(qū)域的連鎖不平衡情況，我們從17q21區(qū)域選取了5個(gè)單核苷酸多態(tài)位點(diǎn)(SNP):rs7216389，rs12603332，rs12936231，rs9303277，rs11557467進(jìn)行基于群體的病例對(duì)照關(guān)聯(lián)分析。
　　 結(jié)果發(fā)現(xiàn)這5個(gè)SNP多態(tài)位點(diǎn)均與成人哮喘顯著相關(guān)（P＜

7、0.05），其中兩個(gè)SNP多態(tài)位點(diǎn)rs9303277，rs11557467與成人哮喘的相關(guān)性最強(qiáng)(P＜0.001)。帶有rs11557467位點(diǎn)G等位基因的個(gè)體或者rs9303277位點(diǎn)C等位基因的個(gè)體的哮喘患病風(fēng)險(xiǎn)顯著升高（OR=1.27，95％CI1.07-1.51，P=0.006以及OR=1.27，95％CI1.07-1.49，P=0.005）。即使是在去除性別和年齡的影響以后，這種相關(guān)性仍然存在。此外，單體型分析發(fā)現(xiàn)，與單體型T

8、CCCG相比，單體型CTGTT具有保護(hù)效應(yīng)，OR=0.81，95％CI0.67-0.97，P=0.02。
　　 因此，本部分研究結(jié)果表明:ORMDL3基因所在的17q21區(qū)域中的遺傳多態(tài)在中國(guó)漢族人群中與成人哮喘顯著相關(guān)。
　　 第二部分17q21區(qū)域?qū)е孪赘械墓δ躍NP的鑒定
　　 由于在Ensembl數(shù)據(jù)庫(kù)中顯示ORMDL3基因具有2種轉(zhuǎn)錄本形式:ENST00000304046(ORMDL3-001)以及

9、ENST00000394169(ORMDL3-002),并且這兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的編碼區(qū)域是完全相同的，不同的只是非翻譯區(qū)，因此它們所編碼的蛋白質(zhì)是完全一樣的。那么在人體中，ORMDL3基因是以哪一種轉(zhuǎn)錄本形式存在呢？另外，Moffatt等人的研究發(fā)現(xiàn)，在EB病毒感染的哮喘兒童的淋巴母細(xì)胞系中17q21區(qū)域中的遺傳多態(tài)與ORMDL3基因的表達(dá)水平密切相關(guān)，因而提示遺傳多態(tài)調(diào)節(jié)ORMDL3基因表達(dá)的異常很可能在哮喘的發(fā)生中起著一定的作用。但是到目

10、前為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的該區(qū)域中與哮喘相關(guān)的SNP中沒(méi)有一個(gè)是位于ORMDL3基因的編碼區(qū)，而我們第一部分選取的SNP位點(diǎn)rs12603332恰好位于該基因的第一內(nèi)含子中，而已有報(bào)道提示位于內(nèi)含子中的遺傳多態(tài)可能會(huì)影響特定細(xì)胞或組織中基因的轉(zhuǎn)錄剪接。因此，我們首先檢測(cè)了ORMDL3基因在人體不同組織中所使用的轉(zhuǎn)錄本形式以及該基因第一內(nèi)含子中的一個(gè)SNP位點(diǎn)rs12603332的不同等位基因是否影響ORMDL3基因mRNA的剪接。
　　

11、 我們選取rs12603332位點(diǎn)基因型為CC及TT的個(gè)體各5例，同時(shí)選取人體肝臟組織，食管癌組織，大腸癌組織以及肺組織各12例，分別提取DNA和RNA。另外，根據(jù)兩個(gè)轉(zhuǎn)錄本的剪接特點(diǎn)設(shè)計(jì)引物，用PCR擴(kuò)增的方法進(jìn)行檢測(cè):一對(duì)引物能同時(shí)擴(kuò)增出ORMDL3的兩種轉(zhuǎn)錄本形式，用以確定ORMDL3基因是否表達(dá)同時(shí)監(jiān)控cDNA的質(zhì)量，另一對(duì)引物只能擴(kuò)增出第二轉(zhuǎn)錄本，用于檢測(cè)第二轉(zhuǎn)錄本是否存在。結(jié)果顯示，在人體外周血淋巴細(xì)胞、肝臟組織、食管癌組織

12、、大腸癌組織以及肺組織中都只表達(dá)ORMDL3基因的第一轉(zhuǎn)錄本形式:ENST00000304046(ORMDL3-001)，并且不論是CC基因型還是TT基因型(rs12603332位點(diǎn))的個(gè)體都只表達(dá)第一轉(zhuǎn)錄本。因此，rs12603332位點(diǎn)并不影響ORMDL3基因的剪接，那么，該區(qū)域中的遺傳多態(tài)導(dǎo)致哮喘的機(jī)制是什么呢？哪個(gè)位點(diǎn)才是真正的功能位點(diǎn)呢？
　　 由于基因轉(zhuǎn)錄水平的改變是介導(dǎo)哮喘或其他疾病易感的一個(gè)非常重要的機(jī)制，并且基

13、因轉(zhuǎn)錄豐度很可能受到某些改變轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的SNP多態(tài)位點(diǎn)的直接影響。因此，我們檢測(cè)了哮喘患者和正常對(duì)照中ORMDL3基因和GSDMB基因的表達(dá)情況。從山東大學(xué)齊魯醫(yī)院呼吸科收集了61例確診的成人哮喘患者以及70例正常體檢個(gè)體的新鮮外周血，提取DNA及RNA，運(yùn)用實(shí)時(shí)定量PCR的方法進(jìn)行等位基因差異表達(dá)分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞中ORMDL3基因以及GSDMB基因的表達(dá)水平顯著高于正常對(duì)照個(gè)體，P＜0.05，并且攜帶有rs72

14、16389，rs12603332以及rs12936231位點(diǎn)危險(xiǎn)等位基因的個(gè)體，其ORMDL3和GSDMB基因的表達(dá)水平顯著升高，P值均小于0.05。
　　 因此，本部分研究結(jié)果表明:首先，在人體外周血淋巴細(xì)胞、肝臟組織、食管癌組織、大腸癌組織以及肺組織中，ORMDL3基因以第一轉(zhuǎn)錄本的形式存在，并且該基因第一內(nèi)含子中rs12603332位點(diǎn)的不同等位基因并不影響ORMDL3基因mRNA的剪接。其次，成人哮喘患者外周血淋巴細(xì)胞中

15、ORMDL3及GSDMB基因的表達(dá)水平明顯高于正常對(duì)照，并且17q21區(qū)域中與哮喘相關(guān)的遺傳多態(tài)的危險(xiǎn)等位基因能顯著升高這兩個(gè)基因的表達(dá)水平。因此，ORMDL3及GSDMB基因的表達(dá)異常很可能是該區(qū)域誘發(fā)哮喘的潛在機(jī)制。但由于17q21區(qū)域是一個(gè)強(qiáng)連鎖不平衡的區(qū)域，從中篩選出具體的功能位點(diǎn)尚有待于更多的研究來(lái)證實(shí)。
　　 第三部分ORMDL3基因基本啟動(dòng)子的鑒定
　　 第二部分研究結(jié)果表明，ORMDL3基因的表達(dá)異常很可

16、能是導(dǎo)致哮喘發(fā)生的原因之一，而關(guān)于該基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)控機(jī)制目前尚不明確，因此在本部分中我們對(duì)該基因的基本啟動(dòng)子進(jìn)行了分析。
　　 首先，我們克隆了ORMDL3基因轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)至上游約1.5kb的區(qū)域，連入pGL3basic載體中，用雙熒光素酶報(bào)告基因系統(tǒng)分析其啟動(dòng)子活性。此后運(yùn)用系列截短的辦法尋找包含ORMDL3基因基本啟動(dòng)子的最小區(qū)域。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，當(dāng)我們把序列從-68bp截短到-62bp時(shí)，熒光素酶活性迅速下降了70％到80％，表明影

17、響ORMDL3基因啟動(dòng)子活性的反應(yīng)元件應(yīng)該位于-68bp到-62bp之間。為了明確哪個(gè)轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合在這一區(qū)域中影響ORMDL3基因的啟動(dòng)子活性，我們用轉(zhuǎn)錄因子預(yù)測(cè)軟件TESS進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)在轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-64bp到-56bp區(qū)域之間存在一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及激活轉(zhuǎn)錄因子6（STAT6）的結(jié)合位點(diǎn)。EMSA及supershift實(shí)驗(yàn)表明，在體外情況下STAT6能結(jié)合在ORMDL3基因的啟動(dòng)子上。同時(shí)ChIP實(shí)驗(yàn)也表明，在體內(nèi)情況下STAT6

18、也能結(jié)合在ORMDL3基因的啟動(dòng)子上。
　　 本部分實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，ORMDL3基因的基本啟動(dòng)子區(qū)域位于轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-68bp以內(nèi)，并且轉(zhuǎn)錄起始點(diǎn)上游-64bp到-56bp區(qū)域之間的一個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)及激活轉(zhuǎn)錄因子6(STAT6)的結(jié)合位點(diǎn)對(duì)ORMDL3基因的基本啟動(dòng)子活性起主要作用。
　　 第四部分STAT6對(duì)ORMDL3基因的表達(dá)調(diào)控作用
　　 既然ORMDL3基因啟動(dòng)子區(qū)域中的STAT6結(jié)合位點(diǎn)對(duì)ORMDL3基因

19、的基本啟動(dòng)子活性起主要作用，那么STAT6對(duì)ORMDL3基因的表達(dá)調(diào)控作用具體是怎樣的呢？為此，我們構(gòu)建了STAT6的表達(dá)載體，在Jurkat細(xì)胞中分別轉(zhuǎn)染STAT6的表達(dá)載體或者STAT6的siRNA，結(jié)果發(fā)現(xiàn)STAT6的高表達(dá)或者低表達(dá)能顯著轉(zhuǎn)錄激活或者轉(zhuǎn)錄抑制ORMDL3基因基本啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因活性及內(nèi)源性O(shè)RMDL3基因mRNA的表達(dá)。由于STAT6是一個(gè)受細(xì)胞因子IL-4/IL-13調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子，那么ORMDL3基因

20、的表達(dá)是否也受IL-4/IL-13的調(diào)控呢？因此，我們還檢測(cè)了IL-4/IL-13對(duì)ORMDL3基因表達(dá)的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)IL-4/IL-13處理能顯著激活ORMDL3基因啟動(dòng)子的熒光素酶報(bào)告基因活性及內(nèi)源性O(shè)RMDL3基因mRNA的表達(dá)，而一旦干擾了STAT6，這一現(xiàn)象就會(huì)消失，表明IL-4/IL-13對(duì)ORMDL3基因的表達(dá)調(diào)控作用依賴于STAT6。另外，有研究發(fā)現(xiàn)p300也能結(jié)合在ORMDL3基因的啟動(dòng)子上，并且它的結(jié)合位點(diǎn)與我們發(fā)

21、現(xiàn)的STAT6結(jié)合位點(diǎn)基本一致。因此，我們進(jìn)行了ChIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p300確實(shí)也能結(jié)合在ORMDL3基因的啟動(dòng)子上。于是我們又進(jìn)一步進(jìn)行了IP實(shí)驗(yàn)和ChIP-Re-ChIP實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)p300和STAT6能相互結(jié)合，并且它們是以復(fù)合物的形式結(jié)合在ORMDL3基因的啟動(dòng)子上。事實(shí)上，p300是一個(gè)協(xié)同轉(zhuǎn)錄因子，它并不直接結(jié)合在DNA序列上，而是通過(guò)與其他序列特異的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合而被招募到啟動(dòng)子上。
　　 因此，本部分研究結(jié)果表