快速老化APP-PS1阿爾茨海默病小鼠模型的建立及氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)AD三轉(zhuǎn)基因小鼠D421位點(diǎn)tau切割的研究.pdf

1、第一部分快速老化APP/PS1阿爾茨海默病小鼠模型的建立
　　阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease，AD)是一種與年齡密切相關(guān)的神經(jīng)退行性疾病，其特點(diǎn)是記憶逐漸和永久性喪失。AD的病理遺傳原因主要是淀粉樣前體蛋白(amyloid precursor protein，APP)和早老素1(presenilin1，PS1)的基因突變。通過(guò)對(duì)AD病理的逐步加深認(rèn)知，研究人員模擬相關(guān)病理為基礎(chǔ)，建立不同的APP轉(zhuǎn)基因模型以研

2、究β-淀粉樣蛋白(beta amyloid，Aβ)斑塊與AD發(fā)病的相互關(guān)系。目前，表達(dá)嵌合小鼠/人APP和突變型人PS1的APP/PS1模型小鼠已被廣泛應(yīng)用于老年癡呆癥相關(guān)的研究。盡管該模型小鼠腦內(nèi)會(huì)出現(xiàn)β-淀粉樣蛋白及認(rèn)知功能障礙，但這些改變大都發(fā)生在小鼠生命后期。鑒于現(xiàn)今APP/PS1小鼠病理改變及認(rèn)知功能出現(xiàn)較遲，因此我們建立了一種以快速老化(senescence accelerated mouse，SAMP8)為背景的APP/P

3、S1小鼠，通過(guò)結(jié)合老化因素及AD相關(guān)基因，該模型能更全面的模擬AD的病理及行為學(xué)改變的小鼠模型。
　　為了驗(yàn)證該模型的行為及病理改變，我們給模型小鼠進(jìn)行了一系列的行為學(xué)及腦病理觀察。采用開(kāi)場(chǎng)及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)，我們觀察了小鼠的自主活動(dòng)能力及焦慮水平。為了檢測(cè)小鼠的學(xué)習(xí)記憶，我們也對(duì)小鼠進(jìn)行了穿梭箱及morris水迷宮實(shí)驗(yàn)。進(jìn)一步的尼氏染色，剛果紅染色及Aβ免疫組織化學(xué)法觀察了小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元病變及淀粉樣蛋白沉積。最后，采用超氧化物歧

4、化酶，過(guò)氧化氫酶，谷胱甘肽還原酶及丙二醛試劑盒，我們也分別測(cè)定小鼠腦內(nèi)的氧化應(yīng)激水平。
　　開(kāi)場(chǎng)及高架十字迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示9月齡SAMP8 APP/PS1小鼠表現(xiàn)過(guò)度活躍及處于低焦慮狀態(tài)。穿梭箱分析結(jié)果表明，9月齡 SAMP8 APP/PS1小鼠學(xué)習(xí)記憶出現(xiàn)障礙。Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果也顯示9月SAMP8 APP/PS1小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力受到損害。進(jìn)一步的形態(tài)學(xué)結(jié)果顯示，與同齡正常對(duì)照小鼠比較，9月齡SAMP8 APP/PS

5、1小鼠皮質(zhì)及海馬區(qū)出現(xiàn)較嚴(yán)重的神經(jīng)元丟失。剛果紅染色顯示，大量的淀粉樣變性出現(xiàn)在9月齡的SAMP8 APP/PS1小鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)中。Aβ免疫組化檢測(cè)結(jié)果顯示，SAMP8 APP/PS1小鼠皮質(zhì)和海馬區(qū)Aβ免疫陽(yáng)性反應(yīng)始于6月齡，隨著老化加重，更多的Aβ出現(xiàn)在SAMP8 APP/PS1小鼠腦中。結(jié)果也顯示SAMP8 APP/PS1小鼠腦內(nèi)超氧化物歧化酶，過(guò)氧化氫酶，谷胱甘肽還原酶活性明顯較低，而脂質(zhì)氧化產(chǎn)物丙二醛則明顯升高，說(shuō)明該小鼠腦

6、內(nèi)氧化水平升高。
　　通過(guò)行為學(xué)及病理學(xué)觀察，發(fā)現(xiàn)SAMP8 APP/PS1小鼠能較好的模擬AD的病理改變，包括腦內(nèi)較多神經(jīng)元丟失、淀粉樣蛋白沉積和較高的氧化水平。SAMP8 APP/PS1小鼠也出現(xiàn)了較嚴(yán)重的行為學(xué)異常，如自主活動(dòng)增加，低焦慮及學(xué)習(xí)認(rèn)知功能的缺失。
　　本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，快速老化 SAMP8和APP/PS1突變的結(jié)合加劇了新型AD模型SAMP8 APP/PS1小鼠的AD病理及行為改變，相比之下傳統(tǒng)的C57 A

7、PP/PS1及SAMP8模型小鼠的病理及異常行為改變明顯較少。因此，SAMP8 APP/PS1為AD的研究提供一個(gè)更理想的動(dòng)物模型。
　　第二部分氧化應(yīng)激調(diào)節(jié)AD三轉(zhuǎn)基因小鼠D421位點(diǎn)tau切割的研究
　　Tau蛋白是一種微管相關(guān)蛋白，異常修飾的tau蛋白則是神經(jīng)原纖維纏結(jié)(neurofibrillary tangles，NFTs)的主要組成成分。NFTs被證實(shí)為AD的主要病理生理學(xué)特征之一，也是導(dǎo)致神經(jīng)元變性的重要因素之

8、一。研究表明，具有神經(jīng)毒性的tau蛋白可能不是成熟的NFTs而是以pretangle形式存在的修飾后tau蛋白，其中tau于D421(Asp421)位點(diǎn)的切割與AD的病理進(jìn)程相關(guān)。越來(lái)越多的實(shí)驗(yàn)表明，由半胱氨酸蛋白酶(caspase)誘導(dǎo)，在D421位點(diǎn)切割的tau是AD主要病理原因之一。
　　研究證實(shí)小鼠腦內(nèi)tau蛋白在D421位點(diǎn)的切割與活化的caspase和纖維狀的tau是共定位的。研究也表明活性氧水平升高是AD發(fā)生的一個(gè)早

9、期因素，活性氧水平升高促進(jìn)小鼠腦內(nèi)D421位點(diǎn)tau切割；而體外實(shí)驗(yàn)中氧化應(yīng)激提高則可引起細(xì)胞caspase6活性增強(qiáng)。相關(guān)AD研究也發(fā)現(xiàn)，caspase的激活優(yōu)先于tau蛋白于D421位點(diǎn)的切割，推斷 tau蛋白D421的切割可能AD發(fā)病中早期的重要過(guò)程。因此我們的假說(shuō)認(rèn)為氧化應(yīng)激可能通過(guò)激活caspase6催化D421位點(diǎn)tau切割參與AD病人腦內(nèi)NFTs的形成。
　　為了驗(yàn)證以上假說(shuō)，我們分別給予了APP/PS1/tau A

10、D模型小鼠氧化劑及抗氧化劑的處理。通過(guò)水迷宮實(shí)驗(yàn)，尼氏染色，剛果紅染色及氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)檢測(cè)（超氧化物歧化酶，過(guò)氧化氫酶，谷胱甘肽還原酶及丙二醛測(cè)試），我們檢測(cè)了氧化及抗氧化對(duì)該小鼠腦內(nèi)的神經(jīng)元，淀粉樣蛋白及氧化應(yīng)激水平的影響。除此之外，我們也采用免疫印跡法檢測(cè)caspase6蛋白及tau蛋白于D421位點(diǎn)的切割情況，最后通過(guò)免疫組織化學(xué)及共聚焦顯微鏡觀察以確定氧化應(yīng)激的升高是否誘導(dǎo)caspase6與tau蛋白于D421位點(diǎn)切割。

11、>　　水迷宮實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示氧化應(yīng)激組小鼠空間學(xué)習(xí)記憶能力降低。尼氏染色觀察小鼠神經(jīng)元結(jié)果顯示，氧化應(yīng)激組小鼠腦內(nèi)神經(jīng)元數(shù)量明顯減少。剛果紅染色及Aβ免疫組化結(jié)果也顯示，與模型及抗氧化劑處理小鼠比較，較多的淀粉樣蛋白沉積在氧化應(yīng)激組小鼠腦內(nèi)的皮質(zhì)及海馬區(qū)。氧化水平相關(guān)酶的檢測(cè)結(jié)果顯示氧化應(yīng)激小鼠腦內(nèi)的相關(guān)過(guò)氧化酶-超氧化物歧化酶，過(guò)氧化氫酶及谷胱甘肽過(guò)氧化酶明顯降低，而脂質(zhì)氧化水平則明顯升高。免疫印跡結(jié)果表明，氧化應(yīng)激小鼠腦內(nèi)caspase

12、6明顯升高；tau C3的表達(dá)水平也明顯提高，這提示caspase6的激活誘導(dǎo)了tau蛋白于D421位點(diǎn)的切割。進(jìn)一步的免疫熒光共定位結(jié)果顯示caspase6表達(dá)區(qū)域出現(xiàn)了tau C3的共定位，再次證明了兩者之間是存在因果關(guān)系的。
　　綜合本實(shí)驗(yàn)結(jié)果，我們發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激能引發(fā)腦內(nèi)一系列的病理改變，同時(shí)伴隨著行為學(xué)和認(rèn)知功能障礙。我們也發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激提高小鼠腦內(nèi)相關(guān)氧化水平，導(dǎo)致caspase6表達(dá)升高及D421位點(diǎn)tau切割增加。