丹皮酚對阿爾茨海默病模型大鼠抗氧化應(yīng)激損傷機(jī)制的研究.pdf

1、目的:阿爾茨海默病(Alzheimer's disease，AD)是一種中樞神經(jīng)系統(tǒng)的退行性疾病，年齡是該病危險因素，隨著年齡增加，發(fā)病率逐年增高，隨著病情發(fā)展，患者會逐漸出現(xiàn)記憶力、認(rèn)知功能減退及情感改變，直至生活不能自理。神經(jīng)纖維纏結(jié)（neurofibrillary tangles，NFTs）、老年斑(senile plaques，SP)及神經(jīng)元的丟失是其三大病理特征。大量證據(jù)表明Aβ作為老年斑的主要成分，在AD的發(fā)病及發(fā)展中起到很

2、重要的作用。另有研究證實(shí)Aβ的毒性作用與氧自由基有關(guān)，Aβ可損傷細(xì)胞膜，誘導(dǎo)氧化應(yīng)激的產(chǎn)生。近年來研究發(fā)現(xiàn)氧化應(yīng)激是AD大腦內(nèi)除了上述三大病理特征外另一個比較重要的病理特征。氧化應(yīng)激出現(xiàn)在AD患者的早期，在AD發(fā)生及發(fā)展中起到重要作用，鑒于氧化應(yīng)激在AD發(fā)病中的重要作用，抗氧化應(yīng)激治療亦成為AD治療的研究熱點(diǎn)。但是研究證實(shí)抗氧化應(yīng)激治療在AD的治療當(dāng)中效果欠佳，可能與其只將對氧化應(yīng)激某一方面作為靶點(diǎn)有關(guān)系。
　　近年來研究發(fā)現(xiàn)Nr

3、f2[NF-E2(Nuclear factor-erythroid2)related factor2]是一種重要的核轉(zhuǎn)錄因子，在細(xì)胞抗氧化應(yīng)激反應(yīng)中起著很重要的作用。在生理?xiàng)l件下，Nrf2與錨定蛋白Keap-1結(jié)合存在于細(xì)胞質(zhì)中，處于惰性狀態(tài)，當(dāng)機(jī)體在病理?xiàng)l件下，Nrf2被激活，與Keap1分離轉(zhuǎn)入細(xì)胞核，與抗氧化反應(yīng)元件(anti-oxidant response element，ARE)結(jié)合，從而啟動一系列的抗氧化物質(zhì)的合成來對抗氧

4、化應(yīng)激。其中Nrf2誘導(dǎo)產(chǎn)生的血紅素加氧酶(HO-1)具有神經(jīng)保護(hù)作用，HO-1催化血紅素生成的產(chǎn)物亦是體內(nèi)強(qiáng)有力的自由基清除劑。研究表明，在AD患者大腦神經(jīng)元內(nèi)的Nrf2大幅減少。p38MAPK屬于絲裂原活化蛋白激酶家族，受機(jī)體內(nèi)外各種刺激而磷酸化，如氧化應(yīng)激、炎癥等，從而介導(dǎo)炎癥及凋亡等效應(yīng)。研究表明，在AD大鼠模型的大腦中，有活性的磷酸化p38MAPK(pp38MAPK)表達(dá)增加。另有研究證實(shí)，在轉(zhuǎn)基因敲除p38MAPK的小鼠中，

5、Nrf2通路被激活，HO-1的表達(dá)增加。
　　丹皮酚(Paeonol，Pae)是從蘿摩科植物徐長卿干燥根或全草和毛莨科植物牡丹根皮中提取出來的一種有效的活性成分。丹皮酚具有抗炎、抗腫瘤、鎮(zhèn)靜、鎮(zhèn)痛、保護(hù)血管等作用。研究證實(shí)，丹皮酚對Aβ誘導(dǎo)的AD大鼠模型的學(xué)習(xí)記憶能力有保護(hù)性作用，亦能減輕由Aβ誘導(dǎo)的炎性反應(yīng)。本研究旨在探索丹皮酚能否通過下調(diào)p38MAPK的表達(dá)來激活Nrf2/ARE通路，從而誘導(dǎo)HO-1的表達(dá)。本實(shí)驗(yàn)通過建立AD

6、大鼠模型，觀察大鼠行為學(xué)的改變以及p38MAPK、Nrf2、HO-1在大鼠海馬組織中的表達(dá)情況，進(jìn)一步探討AD的發(fā)病機(jī)理和丹皮酚發(fā)揮神經(jīng)保護(hù)作用可能的機(jī)制。
　　方法:68只健康成年SD雄性大鼠，清潔級，體重250±50g，按隨機(jī)數(shù)字表分為假手術(shù)組（Sham），假手術(shù)+丹皮酚組(sham+Pae100mg/kg)AD模型組，和AD+丹皮酚組（AD+Pae100mg/kg），每組17只。適應(yīng)性飼養(yǎng)1周后兩個給藥組按丹皮酚100mg/

7、kg灌胃給藥3周，余兩組給予等量生理鹽水。給藥三周后應(yīng)用立體定位儀建立AD模型，方法為向雙側(cè)海馬區(qū)各注射10μg Aβ1-42。造模七天后應(yīng)用Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)測試?yán)鲜?，觀察丹皮酚對大鼠空間學(xué)習(xí)記憶的影響，并檢測四組大鼠海馬區(qū)SOD活力及MDA含量，通過HE染色觀察大鼠海馬CA1區(qū)錐體細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化，采用Western Blot法測定p38MAPK，Nrf2及HO-1的在大鼠海馬區(qū)的含量。
　　結(jié)果:
　　1、Morr

8、is水迷宮實(shí)驗(yàn):4組大鼠的逃避潛伏期不同(F=91.36，P＜0.05)，穿越平臺次數(shù)有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=26.30，P＜0.05)。與AD組相比，余3組逃避潛伏期明顯減少(P＜0.05），穿越平臺次數(shù)明顯增多(P＜0.05)。
　　2、HE染色:Sham組及Sham+Pae組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元排列規(guī)整，形態(tài)正常，分布均勻，結(jié)構(gòu)致密;AD組海馬CA1區(qū)神經(jīng)元細(xì)胞排列稀疏，結(jié)構(gòu)紊亂，且數(shù)量較Sham組明顯減少;AD+Pae組與AD模型

9、組相比，大鼠海馬區(qū)錐體細(xì)胞數(shù)量，形態(tài)和結(jié)構(gòu)均有不同程度的恢復(fù)，神經(jīng)元數(shù)量增多，排列較整齊，分布較均勻。
　　3、免疫組織化學(xué)結(jié)果
　　免疫組化結(jié)果示:Nrf2表達(dá)于錐體細(xì)胞的胞質(zhì)與胞核內(nèi)，AD組與其余三組相比，Nrf2表達(dá)水平下降。HO-1在四組大鼠海馬組織錐體細(xì)胞均主要表達(dá)于胞質(zhì)內(nèi)，AD組與其余三組相比，HO-1表達(dá)水平下降，pp38MAPK在四組大鼠海馬組織錐體細(xì)胞均主要表達(dá)于胞核內(nèi)，AD組與其余三組相比，pp38MAP

10、K表達(dá)水平升高。
　　4、SOD及MDA含量測定:四組大鼠的海馬組織SOD活力不同(F=238.28 P＜0.05)，Sham組較AD組大鼠海馬組織SOD活力處于較高水平(P＜0.05)，AD+Pae組大鼠海馬組織SOD活力較AD組的水平高(P＜0.05)。
　　四組大鼠海馬組織MDA含量不同(F=68.89P＜0.05)，Sham組大鼠海馬組織MDA含量較AD組少(P＜0.05)，AD+Pae組較AD組大鼠海馬組織MDA含

11、量降低(P＜0.05）。
　　5、丹皮酚對pp38MAPK，Nrf2及HO-1表達(dá)水平的影響:在AD模型組，pp38MAPK的蛋白表達(dá)水平較Sham組明顯增多(P＜0.05），Nrf2及HO-1的蛋白表達(dá)水平較Sham組明顯降低(P＜0.05); AD+Pae組的pp38MAPK蛋白表達(dá)水平明顯下降，Nrf2及HO-1的蛋白表達(dá)水平較Sham組明顯增高，與AD模型組相比結(jié)果有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05)。
　　結(jié)論:1、采用雙

12、側(cè)海馬區(qū)注射凝聚態(tài)Aβ1-42建立AD模型，大鼠出現(xiàn)了學(xué)習(xí)記憶能力減退及相應(yīng)病理改變，證明AD大鼠模型制作是成功且有效的。2、AD模型組大鼠海馬區(qū)SOD活力降低，MDA含量升高，說明AD模型鼠大腦中存在氧化應(yīng)激。3、丹皮酚可以改善AD大鼠的學(xué)習(xí)記憶能力，減少AD大鼠腦內(nèi)氧化應(yīng)激反應(yīng)，說明其對AD有神經(jīng)保護(hù)作用。4、丹皮酚在一定程度上下調(diào)了p38MAPK的表達(dá)，上調(diào)了Nrf2及HO-1的表達(dá)，從而激活了體內(nèi)的抗氧化應(yīng)激系統(tǒng)，丹皮酚通過抑制