錳職業(yè)接觸工人生物標(biāo)志物的研究.pdf

1、錳是機(jī)體代謝的必需微量元素之一，適量的錳在體內(nèi)充當(dāng)某些酶的活性基團(tuán)、激活因子等，同時(shí)參與中樞神經(jīng)的生理功能。錳及其化合物又是重要的工業(yè)原料，應(yīng)用廣泛，常用于電焊作業(yè)以增強(qiáng)焊接的硬度和強(qiáng)度。工業(yè)中錳過量接觸會(huì)導(dǎo)致職業(yè)性錳中毒的發(fā)生，對(duì)機(jī)體的神經(jīng)、免疫、生殖等各方面造成損傷。我國錳的消耗量超過千萬噸，職業(yè)性慢性錳中毒的發(fā)生率較高，給國家造成巨大經(jīng)濟(jì)損失。目前慢性錳中毒無經(jīng)濟(jì)有效的治療方法，而且國家對(duì)其診斷無統(tǒng)一有效的標(biāo)準(zhǔn)，早期外周組織相應(yīng)的

2、標(biāo)志物檢測亦無相應(yīng)的有力證據(jù)。之前的大多數(shù)研究都是檢測工作場所周圍空氣中的平均錳濃度，而忽略了個(gè)體錳實(shí)際暴露劑量的測定。本課題即是從個(gè)體錳實(shí)際暴露劑量出發(fā)，研究暴露劑量與生物材料中各指標(biāo)之間的相關(guān)性，以尋找合適的生物標(biāo)志物為錳的接觸評(píng)價(jià)提供依據(jù)。 目的： 建立一種能同時(shí)測定人尿液中高香草酸和香草扁桃酸含量的高效液相色譜熒光檢測方法，并探討錳接觸工人個(gè)體實(shí)際接觸劑量與生物指標(biāo)之間的關(guān)系以尋找合適的早期生物學(xué)監(jiān)測指標(biāo)。

3、 方法： 本課題選擇濟(jì)南市某機(jī)車車輛廠電焊作業(yè)工人270名，其中男238人，女32人，均排除各種肝、腎疾病，無其他毒物接觸史，無長期藥物服用史。收集此270人的血液和尿液進(jìn)行分析。 對(duì)尿液中高香草酸和香草扁桃酸的測定進(jìn)行方法學(xué)摸索和驗(yàn)證。根據(jù)文獻(xiàn)參考，選擇高效液相色譜—熒光檢測器的方法測定。尿樣經(jīng)0．45μm濾膜過濾后直接進(jìn)樣，經(jīng)ODS色譜柱（250 mm×4．6 mm，5．0μm）室溫分離，以甲醇—0．1 mol/L

4、 pH=5．6的磷酸鹽緩沖液（體積比20：80）為流動(dòng)相，流量1 ml/min，進(jìn)樣量10μl，激發(fā)波長277 nm，發(fā)射波長320 nm。 火焰原子吸收光譜法測定血錳、尿錳和個(gè)體錳暴露劑量；高效液相色譜—熒光法測定尿中高香草酸和香草扁桃酸；從血液中提取DNA進(jìn)行谷氨酸脫羧酶67（GAD67）和血紅素加氧酶—1（HO—1）基因多態(tài)性分析，GAD67采用PCR結(jié)合限制性內(nèi)切酶（MnlⅠ）進(jìn)行片段長度多態(tài)性（RFLP）分析；HO—1

5、則通過研究啟動(dòng)子（GT）序列的長度進(jìn)行多態(tài)性分析。對(duì)各指標(biāo)進(jìn)行相關(guān)性研究和方差分析。 結(jié)果： 尿中高香草酸和香草扁桃酸的分離測定過程在15 min之內(nèi)完成，香草扁桃酸、高香草酸保留時(shí)間分別為3．18、6．54 min。高香草酸檢出限為0．15μg/ml。線性范圍0～25μg/ml，加標(biāo)回收率84．5%～102．1%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<3．44%。香草扁桃酸檢出限為0．13μg/ml，線性范圍0—20μg/ml，加標(biāo)回收率94

6、．7%～101．3%，相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差<2．16%。 個(gè)體錳與血錳、尿錳之間均無相關(guān)性，提示血錳、尿錳均不能作為評(píng)價(jià)錳實(shí)際接觸劑量的指標(biāo)，即不能作為評(píng)價(jià)錳接觸的暴露生物標(biāo)志。 個(gè)體錳暴露劑量與尿HVA之間有負(fù)相關(guān)性（r=—0．168，P<0．01），且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義；與尿中HVA、VMA的均值有負(fù)相關(guān)性（r=—0．172，P<0．01），且有顯著統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。提示尿HVA、尿中二酸均值隨著個(gè)體錳接觸劑量的增加呈下降趨勢，二者

7、均可以作為職業(yè)性錳中毒診斷的效應(yīng)生物標(biāo)志物指標(biāo)評(píng)價(jià)錳接觸的情況。 DNA經(jīng)擴(kuò)增、MnlⅠ酶切后將GAD67分為CC、TC、TT三種基因型，共測定132份樣品。按個(gè)體錳暴露將其分為高、低兩組，分析組內(nèi)各基因型對(duì)應(yīng)的工人尿HVA、HVA與VMA均值之間的差異。方差分析結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示GAD67的MnlⅠ酶切位點(diǎn)不能作為評(píng)價(jià)錳接觸的遺傳易感性生物標(biāo)志。 DNA經(jīng)擴(kuò)增、銀染后將HO—1的啟動(dòng)子重復(fù)序列長度分為S/S，S/M

8、，S/L，M/M，M/L和L/L六種基因型，共測定樣品132份。按個(gè)體錳暴露將其分為高、低兩組，分析組內(nèi)各基因型對(duì)應(yīng)的工人尿HVA、HVA與VMA均值之間的差異，方差分析結(jié)果無統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。按是否含有L等位基因把六種基因型分為兩類基因型，比較兩組內(nèi)工人尿HVA、HVA與VMA均值之間的差異，t檢驗(yàn)結(jié)果顯示兩組內(nèi)的兩類基因型之間均有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異，提示HO—1基因的L等位基因可以作為評(píng)價(jià)錳接觸的遺傳易感性生物標(biāo)志。 結(jié)論： 本實(shí)

9、驗(yàn)樣品前處理簡單，樣品穩(wěn)定，保存時(shí)間長；方法靈敏度高、重現(xiàn)性好。完成一次樣品分析需要15 min，標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。方法各項(xiàng)指標(biāo)均達(dá)到《生物材料分析方法的研制準(zhǔn)則》的要求，能準(zhǔn)確測定尿液中高香草酸和香草扁桃酸的含量，適用于大批樣品的測定。 血錳、尿錳均不能作為評(píng)價(jià)錳接觸的暴露生物標(biāo)志；尿HVA、尿中HVA與VMA的均值都可以作為評(píng)價(jià)錳接觸的效應(yīng)生物標(biāo)志，尿VMA則不可以；年齡、性別是錳接觸效應(yīng)發(fā)生的重要影響因素。GAD67 Mn