嗅鞘細(xì)胞的培養(yǎng)及其生物學(xué)特性的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、近年來，脊髓損傷(Spinal cord injury,SCI)的再生與修復(fù)研究取得了很大進(jìn)展，細(xì)胞移植被認(rèn)為是最有前景的治療方法之一。嗅鞘細(xì)胞（Olfactory ensheathing cells,OECs）因其獨(dú)特的生物學(xué)特性越來越受到人們的注意。OECs移植入受損的脊髓部位后，可以排列成細(xì)胞鏈，引導(dǎo)促進(jìn)神經(jīng)元軸突再生通過損傷部位，并可促進(jìn)多種神經(jīng)細(xì)胞的生長(zhǎng)及軸突的延長(zhǎng)，研究發(fā)現(xiàn)，OECs可成功促進(jìn)下行傳導(dǎo)通路的再生。因此，OEC

2、s被認(rèn)為是細(xì)胞移植修復(fù)SCI最有希望的種子細(xì)胞之一。
　　一、OECs對(duì)培養(yǎng)神經(jīng)元生長(zhǎng)狀態(tài)的影響
　　培養(yǎng)新生SD大鼠脊髓背根神經(jīng)節(jié)神經(jīng)元(Dorsal root ganglion neurons,DRGn)與成年SD大鼠OECs，將DRGn與不同濃度(8×105/ml、4×105/ml、2×105/ml、105/ml、104/ml)OECs共培養(yǎng)。共培養(yǎng)3天后在倒置相差顯微鏡下觀察神經(jīng)元生長(zhǎng)發(fā)育情況；行抗NSESABC免疫

3、組織化學(xué)染色并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)；行抗GAP-43免疫熒光染色；同時(shí)采用MTT法測(cè)定神經(jīng)元活性。對(duì)各組結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。結(jié)果表明：各共培養(yǎng)組神經(jīng)元生長(zhǎng)密度明顯高于對(duì)照組，神經(jīng)元胞體大而飽滿，突起較長(zhǎng)，細(xì)胞活性也高于對(duì)照組。三、OECs對(duì)體外誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡相關(guān)基因表達(dá)的影響
　　二、OECs對(duì)H2O2誘導(dǎo)神經(jīng)元凋亡的影響
　　培養(yǎng)新生SD大鼠DRGn與成年SD大鼠OECs。向DRGn培養(yǎng)基內(nèi)加入終濃度為1mmol/L的H2O2誘導(dǎo)

4、其凋亡，然后與密度為2×105/ml的OECs共培養(yǎng)。于共培養(yǎng)24h后采用流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定DRGn細(xì)胞凋亡率，RT-PCR及Westernblot技術(shù)檢測(cè)DRGn凋亡相關(guān)基因FADD、Bcl-2、BAX、Bim、Caspase-3的表達(dá)。結(jié)果表明：DRGn培養(yǎng)基中加入H2O2后與OECs共培養(yǎng)培養(yǎng)新生SD大鼠DRGn與成年SD大鼠OECs。向DRGn培養(yǎng)基內(nèi)加入終濃度為1mmol/L的H2O2誘導(dǎo)其凋亡，然后立刻與不同密度(104/ml

5、、105/ml、2×105/ml、8×105/ml)的OECs共培養(yǎng)；以及在加入H2O2后的不同時(shí)間(0h、4h、8h、12h、24h)與OECs共培養(yǎng)。各組DRGn分別于共培養(yǎng)24h后進(jìn)行Tunel凋亡染色、流式細(xì)胞技術(shù)測(cè)定細(xì)胞凋亡率及MTT法檢測(cè)細(xì)胞活性。結(jié)果表明：DRGn培養(yǎng)基中加入H2O2誘導(dǎo)凋亡后，與不同密度OECs共培養(yǎng)24h，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率均明顯低于對(duì)照組，細(xì)胞活性明顯高于對(duì)照組，且隨著共培養(yǎng)的OECs接種密度的增加，細(xì)胞

6、凋亡率隨之降低、細(xì)胞活性升高。但當(dāng)OECs接種密度升高至2×105/ml后，再增加OECs的接種密度，上述指標(biāo)變化并不明顯；DRGn培養(yǎng)基中加入H2O2誘導(dǎo)凋亡，于加入H2O2后不同時(shí)間與OECs共培養(yǎng)24h。檢測(cè)DRGn凋亡率在0h、4h、8h、12h組均明顯低于對(duì)照組，且隨著與OECs共培養(yǎng)時(shí)間的推遲，凋亡率隨之升高。當(dāng)加入H2O2后24h再與OECs共培養(yǎng)組，其細(xì)胞凋亡率與對(duì)照組相比并無明顯區(qū)別。結(jié)論：OECs可明顯抑制H2O2誘

7、導(dǎo)的DRGn凋亡，并在一定的范圍內(nèi)存在密度依賴效應(yīng)與時(shí)間依賴效應(yīng)。
　　且在一定范圍內(nèi)，神經(jīng)元生長(zhǎng)密度隨共培養(yǎng)的OECs接種密度的增加而增加。但當(dāng)OECs達(dá)到一定密度后(2×105/ml)，再增加其接種密度，測(cè)量神經(jīng)元生長(zhǎng)密度并不繼續(xù)隨之增高。結(jié)論：OECs可明顯促進(jìn)體外培養(yǎng)DRGn的生長(zhǎng)，提高細(xì)胞活性，且在一定范圍內(nèi)存在密度依賴效應(yīng)。
　　24h，檢測(cè)細(xì)胞凋亡率明顯低于對(duì)照組，且共培養(yǎng)組BAX、Bim、Caspase-3的

8、表達(dá)量明顯下調(diào)，Bcl-2表達(dá)量明顯上調(diào)。結(jié)論：OECs能通過下調(diào)BAX、Bim表達(dá)、上調(diào)Bcl-2表達(dá)的途徑抑制DRGn凋亡。
　　四、OECs移植修復(fù)大鼠SCI的試驗(yàn)研究
　　培養(yǎng)成年SD大鼠OECs，培養(yǎng)14d后將其自培養(yǎng)瓶中消化下來，制成細(xì)胞懸液，并用Hoechst33342標(biāo)記。使用改良的Allen打擊法制造大鼠T8/9脊髓損傷模型，于損傷同時(shí)用微量注射器向損傷脊髓局部注入5ul密度為2×106/ml的OECs細(xì)胞

9、懸液。于移植后2w觀察OECs的存活狀況及其在脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)的遷移情況；于移植后24h及2w行Tunel凋亡染色觀察原始打擊區(qū)域臨近節(jié)段脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡情況；于移植后4w行NSE及GAP43免疫熒光染色觀察打擊區(qū)域神經(jīng)再生情況；于移植后4w對(duì)試驗(yàn)動(dòng)物行運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：OECs移植后可在損傷部位存活，并在脊髓實(shí)質(zhì)內(nèi)遷移；Tunel凋亡染色顯示移植組原始打擊區(qū)域臨近節(jié)段脊髓神經(jīng)細(xì)胞凋亡數(shù)量明顯低于于對(duì)照組；NSE及GAP43免疫熒光染色

10、顯示移植組打擊區(qū)域神經(jīng)元軸突再生數(shù)量明顯高于對(duì)照組；但試驗(yàn)組及對(duì)照組動(dòng)物運(yùn)動(dòng)功能評(píng)分無明顯區(qū)別。結(jié)論：OECs移植可明顯減輕脊髓空洞及膠質(zhì)瘢痕的形成，促進(jìn)軸突再生，抑制SCI后的神經(jīng)細(xì)胞凋亡。
　　五、人嗅粘膜來源嗅鞘細(xì)胞的分離、培養(yǎng)與純化
　　本研究共收集嗅粘膜標(biāo)本15例，全部來自意外交通或機(jī)械事故死亡的成年男性，年齡23-40歲，確認(rèn)為臨床死亡并征得家屬同意后，常規(guī)碘伏消毒取材區(qū)域，無菌條件下，采用硬質(zhì)鼻內(nèi)窺鏡剝離上鼻甲

11、及中鼻甲內(nèi)側(cè)的嗅粘膜約5mm3，采用胰蛋白酶消化、差速貼壁法純化。在培養(yǎng)的第7、14d，使用倒置相差顯微鏡進(jìn)行形態(tài)學(xué)觀察；同時(shí)行抗NGFRp75免疫熒光染色，鑒定細(xì)胞并計(jì)算染色陽性細(xì)胞率。結(jié)果表明：通過純化及培養(yǎng)，于14d可獲得純度約為75％的OECs，細(xì)胞形態(tài)以帶有細(xì)長(zhǎng)突起的雙極細(xì)胞及三極細(xì)胞為主，有少量的扁平細(xì)胞。結(jié)論:自成人嗅粘膜可成功分離純化出OECs，來源穩(wěn)定，純度達(dá)到移植要求，為開展自體嗅粘膜OECs移植修復(fù)SCI提供了技術(shù)