IBS樣功能性慢性內(nèi)臟痛的痛覺(jué)敏化作用以及離子型谷氨酸受體的作用.pdf

1、本研究籍Al-Chaer模型，探討IBS大鼠脊髓胸腰和腰骶節(jié)段初級(jí)傳入神經(jīng)纖維的敏化作用以及脊髓腰骶神經(jīng)元的敏化作用；進(jìn)而探索NMDA和非NMDA受體在IBS樣功能性慢性內(nèi)臟痛敏中的作用，以期深化理解IBS及功能性慢性內(nèi)臟痛的發(fā)病機(jī)制，為IBS的藥物治療提供新的作用靶點(diǎn)，為IBS的臨床防治提供新的策略與途徑。 1.IBS樣功能性慢性內(nèi)臟痛模型的特點(diǎn)及評(píng)價(jià)。 1.1 Al-Chare模型的改進(jìn)重復(fù)Al-Chare報(bào)道的方法

2、造模，結(jié)果大鼠4wk內(nèi)的存活率不到30％。采用本文改進(jìn)的造模方法，即減少傷害性結(jié)腸刺激(CI)的次數(shù)，僅在出生后第8、10、12天，給予乳鼠60 mmHg壓力的CI刺激，每天1次，共3次，大鼠4wk內(nèi)的的存活率接近90％。提示改進(jìn)造模方法，提高了造模的成功率。此模型組大鼠簡(jiǎn)稱為CI大鼠。 大鼠8wk后，以結(jié)直腸擴(kuò)張(CRD)引起腹壁撤退反射和腹外斜肌放電反應(yīng)為指標(biāo)，了解CI模型大鼠是否出現(xiàn)慢性內(nèi)臟痛敏。 1.2 CI大鼠

3、腹壁撤退反射評(píng)分顯著升高，痛反應(yīng)閾顯著降低。 比較對(duì)照組與CI模型組成年大鼠在清醒狀態(tài)下對(duì)不同強(qiáng)度(20、40、60、80 mmHg)的CRD刺激所產(chǎn)生的行為學(xué)變化。CI組大鼠在20 mniHg CRD刺激下即表現(xiàn)出明顯的疼痛反應(yīng)，其平均腹壁撤退反射(AWR)評(píng)分甚至超過(guò)對(duì)照組大鼠40 mmHg時(shí)的平均評(píng)分。CI大鼠在各個(gè)壓力CRD下AWR評(píng)分均顯著高于對(duì)照大鼠，尤其是在20與40mmHg較低壓力刺激下評(píng)分增高更為顯著。CI組大

4、鼠痛反應(yīng)閾較對(duì)照組顯著降低。提示CI大鼠存在慢性內(nèi)臟痛覺(jué)敏化現(xiàn)象。 比較6 wk與12 wk CI模型組大鼠AWR評(píng)分及痛反應(yīng)閾。雖然與同齡對(duì)照大鼠相比，20～60 nunHg CRD刺激下6wkCI大鼠的AWR評(píng)分顯著增高，痛反應(yīng)閾明顯降低：但不同周齡CI大鼠AWR評(píng)分之間無(wú)顯著性差異。提示CI幼年大鼠即存在內(nèi)臟痛覺(jué)敏化。 1.3 CI大鼠腹外斜肌肌電顯著升高，肌電反應(yīng)閾顯著降低。 比較對(duì)照與CI大鼠在清醒狀態(tài)

5、下對(duì)不同強(qiáng)度(20、40、60、80 nunHg)CRD刺激所引起的肌電反應(yīng)。CI大鼠對(duì)20---80 mmHg各等級(jí)CRD刺激的肌電反應(yīng)均較對(duì)照組顯著增高，平均肌電反應(yīng)閾顯著降低。上述結(jié)果進(jìn)一步證實(shí)了CI大鼠存在內(nèi)臟痛覺(jué)敏化。 1.4 CI大鼠軀體感覺(jué)敏感性增加為明確CI大鼠是否存在軀體感覺(jué)敏化，比較對(duì)照與CI成年大鼠在清醒狀態(tài)下，雙后肢足底皮膚對(duì)熱刺激的敏感性差異。CI大鼠雙后肢皮膚對(duì)熱刺激反應(yīng)的潛伏期較對(duì)照組顯著縮短，提示

6、CI大鼠相應(yīng)的軀體皮膚對(duì)熱刺激的敏感性增加。 1.5 CI大鼠與對(duì)照大鼠體重的比較觀察比較4～12周齡對(duì)照與CI大鼠在同一時(shí)期生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中體重的變化。結(jié)果表明，兩組大鼠體重之間無(wú)顯著性差異，提示造模本身對(duì)CI大鼠體重?zé)o明顯影響。 1.6 CI大鼠與對(duì)照大鼠腹瀉與便秘體征的比較觀察比較對(duì)照與CI大鼠生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中腹瀉、便秘等體征的改變。對(duì)照大鼠無(wú)明顯體征出現(xiàn)；但60％8wkCI大鼠有腹瀉或便秘體征。 1.7 CI

7、大鼠結(jié)直腸局部組織學(xué)的病理變化比較對(duì)照和CI大鼠遠(yuǎn)端降結(jié)腸和直腸的局部組織學(xué)的病理改變。對(duì)照與CI大鼠經(jīng)過(guò)肉眼觀察和顯微鏡檢查，均未見(jiàn)明顯病理改變。 2.CI大鼠原發(fā)傳入神經(jīng)纖維對(duì)結(jié)直腸擴(kuò)張反應(yīng)顯著增強(qiáng)。 2.1 CI大鼠結(jié)直腸擴(kuò)張激活的胸腰和腰骶段傳入神經(jīng)纖維數(shù)目增加CI大鼠可以被CRD激活的傳入神經(jīng)纖維數(shù)量不論是在胸腰，還是在腰骶水平，均比對(duì)照大鼠顯著增多。對(duì)照大鼠在腰骶水平記錄到對(duì)CRD有反應(yīng)的傳入神經(jīng)纖維數(shù)目比在

8、胸腰水平記錄到的顯著增多，而CI大鼠被CRD激活的胸腰和腰骶段傳入神經(jīng)纖維的數(shù)量之間差別無(wú)顯著性。 2.2 CI大鼠胸腰和腰骶段傳入神經(jīng)纖維電緊張電位的改變與對(duì)照大鼠相比，CI大鼠腰骶段(LS)傳入神經(jīng)纖維(DR)電緊張電位(BKG)顯著增高；而CI大鼠胸腰段(TL)DR電緊張電位無(wú)顯著改變。對(duì)照大鼠TL DR(n=14)的平均電緊張電位顯著高于LS DR(n=29)；而CI大鼠，兩者之間則無(wú)顯著性差異。提示造模對(duì)LS DR的電

9、緊張電位有顯著影響，而對(duì)TL DR則無(wú)顯著影響。 2.3 CI大鼠胸腰和腰骶段傳入神經(jīng)纖維興奮閾的改變與對(duì)照大鼠相比，CI大鼠LS DR對(duì)CRD刺激的興奮閾顯著降低。CI大鼠TL DR(n=126)對(duì)CRD的興奮閾與對(duì)照大鼠TL DR(n=1.4)之間差異無(wú)顯著性。對(duì)照大鼠TL DR與LS DR興奮閾之間差異無(wú)顯著性，而CI大鼠LS DR的興奮閾顯著低于TL DR，提示CI大鼠腰骶背根傳入神經(jīng)纖維興奮閾改變較顯著。 2.

10、4 CI大鼠胸腰和腰骶段傳入神經(jīng)纖維對(duì)CRD反應(yīng)的改變。 2.4.1 CI大鼠腰骶傳入神經(jīng)纖維對(duì)各等級(jí)CRD反應(yīng)顯著增強(qiáng)比較對(duì)照與CI大鼠LS DR對(duì)相同強(qiáng)度CRD刺激的反應(yīng)差異。CI大鼠LS DR對(duì)各個(gè)等級(jí)強(qiáng)度CRD刺激的平均反應(yīng)強(qiáng)度均顯著高于對(duì)照大鼠，提示CI大鼠腰骶高、低閾值的初級(jí)傳入神經(jīng)纖維均敏化。 2.4.2 CI大鼠胸腰傳入神經(jīng)纖維對(duì)較高強(qiáng)度CRD反應(yīng)顯著增強(qiáng)比較對(duì)照與CI大鼠TL DR在相同強(qiáng)度CRD刺激下

11、的反應(yīng)。CI大鼠脊髓背根對(duì)40～80 mmHg CRD的平均反應(yīng)較對(duì)照大鼠顯著增高，提示CI大鼠胸腰高閾值的傳入神經(jīng)纖維敏化。 2.4.3 CI大鼠腰骶傳入神經(jīng)纖維對(duì)各等級(jí)CRD反應(yīng)顯著高于胸腰傳入比較TL和LS DR對(duì)CRD的反應(yīng)。對(duì)照大鼠LS DR只對(duì)80 mmHg的CRD的平均反應(yīng)顯著強(qiáng)于TL DR；而CI大鼠LS DR對(duì)20～80 mmHg各個(gè)等級(jí)的CRD的平均反應(yīng)都顯著高于TL DR。提示CI大鼠LS DR對(duì)傷害與非傷

12、害刺激反應(yīng)的強(qiáng)度均顯著高于TL DR，而對(duì)照大鼠LS DR僅對(duì)傷害性刺激反應(yīng)的強(qiáng)度顯著高于TL DR。 3.CI大鼠脊髓神經(jīng)元對(duì)內(nèi)臟與軀體刺激的反應(yīng)增強(qiáng)。 3.1 CI大鼠脊髓腰骶神經(jīng)元對(duì)結(jié)直腸擴(kuò)張刺激的反應(yīng)增強(qiáng)比較對(duì)照與CI大鼠LS脊髓背角神經(jīng)元對(duì)CRD刺激的反應(yīng)。CI大鼠Ls神經(jīng)元對(duì)20～80 mmHg各個(gè)壓力CRD的平均反應(yīng)均顯著高于對(duì)照大鼠。提示CI大鼠LS脊髓背角神經(jīng)元對(duì)傷害與非傷害結(jié)直腸擴(kuò)張刺激的反應(yīng)顯著增強(qiáng)

13、。 3.2 CI大鼠脊髓腰骶神經(jīng)元對(duì)相應(yīng)軀體刺激的反應(yīng)增強(qiáng)比較對(duì)照與CI大鼠LS神經(jīng)元對(duì)傷害與非傷害性各種不同軀體刺激的反應(yīng)。與對(duì)照大鼠相比，CI大鼠LS神經(jīng)元對(duì)傷害與非傷害性各種不同軀體刺激的反應(yīng)均顯著增強(qiáng)。提示CI大鼠除了出現(xiàn)慢性內(nèi)臟痛敏，還伴隨相應(yīng)軀體感覺(jué)敏化。 4 谷氨酸受體在CI模型大鼠慢性內(nèi)臟痛敏中的作用。 4.1 NMDA受體涉及IBS樣功能性慢性內(nèi)臟痛的形態(tài)學(xué)證據(jù)。 4.1.1 CI大鼠脊

14、髓背根神經(jīng)節(jié)NMDA受體NR2B亞單位表達(dá)增強(qiáng)采用免疫組織化學(xué)方法，比較對(duì)照與CI大鼠背根神經(jīng)節(jié)NMDA受體NR2B亞單位的表達(dá)。.圖像分析結(jié)果，CI大鼠NR2B表達(dá)的平均光密度較對(duì)照組顯著升高。提示CI大鼠背根神經(jīng)節(jié)NMDA受體NR2B亞單位可能涉及IBS樣功能性慢性內(nèi)臟痛的外周敏化機(jī)制。 4.1.2 CI大鼠脊髓內(nèi)臟相關(guān)神經(jīng)元NMDA受體NR2B亞單位表達(dá)增強(qiáng)采用免疫組織化學(xué)方法，比較對(duì)照與CI大鼠脊髓背角神經(jīng)元NMDA受體

15、NR2B亞單位的表達(dá)。圖像分析結(jié)果，CI大鼠胸腰和腰骶段NR2B亞單位表達(dá)的平均光密度均顯著高于對(duì)照大鼠。提示，CI大鼠脊髓NMDA受體NR2B亞單位可能涉及IBS樣功能性慢性內(nèi)臟痛的脊髓敏化機(jī)制。 4.2 NMDA受體在IBS樣功能性慢性內(nèi)臟痛敏中的作用。 4.2.1腹腔注射AP-7顯著抑制CI大鼠腰骶傳入神經(jīng)纖維對(duì)CRD刺激的反應(yīng)本研究選用中等劑量AP-7(0.5 mg/kg，i.p.)，比較對(duì)照和CI大鼠給藥前后L

16、S DR對(duì)20～80mmHg CRD的反應(yīng)。結(jié)果顯示，NMDA受體拮抗劑AP-7顯著抑制對(duì)照和CI大鼠LS DR對(duì)20～80 mmHg CRD的反應(yīng))，CI大鼠AP-7的抑制百分率顯著高于對(duì)照大鼠。提示體內(nèi)NMDA受體可能介導(dǎo)IBS樣功能性慢性內(nèi)臟痛敏。 4.2.2脊髓局部給予AP-7顯著抑制CI大鼠腰骶神經(jīng)元對(duì)CRD刺激的反應(yīng)。 結(jié)果提示，脊髓NMDA受體參與介導(dǎo)IBS樣功能性慢性內(nèi)臟痛敏。 4.3脊髓非NMD

17、A受體在IBS樣功能性慢性內(nèi)臟痛敏中的作用。 4.3.1脊髓局部給予CNQX抑制CI大鼠腰骶神經(jīng)元對(duì)CRD反應(yīng)的百分?jǐn)?shù)比較脊髓局部給予相同劑量CNQX在對(duì)照與CI大鼠之間對(duì)腰骶神經(jīng)元產(chǎn)生效應(yīng)的百分?jǐn)?shù)。與對(duì)照大鼠相比，相同劑量CNQX對(duì)CI大鼠神經(jīng)元產(chǎn)生效應(yīng)的百分?jǐn)?shù)較大。 4.3.2脊髓局部給予CNQX抑制CI大鼠腰骶神經(jīng)元對(duì)CRD的反應(yīng)比較脊髓局部給予不同濃度CNQX抑制對(duì)照與CI大鼠腰骶神經(jīng)元對(duì)CRD刺激反應(yīng)的程度。結(jié)