組胺H3受體拮抗劑對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究.pdf

1、腦缺血主要是由于腦血管內(nèi)發(fā)生血栓、栓塞或其他原因?qū)е履X供血不足而引起的腦梗死，它是導(dǎo)致人類殘疾及死亡的頭號(hào)殺手之一。到目前為止，除了t-PA溶栓外，尚無(wú)有效的治療策略。在過(guò)去的幾十年中，研究者也開(kāi)展了大量關(guān)于神經(jīng)保護(hù)劑的臨床試驗(yàn)，但結(jié)果確是令人遺憾的。主要原因是，目前研究的針對(duì)單一靶點(diǎn)的藥物與腦缺血過(guò)程的復(fù)雜性是相悖的。因此，還需進(jìn)一步充分了解缺血病理過(guò)程的復(fù)雜機(jī)制并開(kāi)發(fā)有效的、溫和的、針對(duì)缺血不同過(guò)程能夠進(jìn)行多靶點(diǎn)治療的神經(jīng)保護(hù)劑。<

2、br>　　組胺是腦內(nèi)一種重要的神經(jīng)遞質(zhì)或調(diào)質(zhì)，組胺能神經(jīng)元胞體位于下丘腦結(jié)節(jié)乳頭核，其神經(jīng)纖維在全腦有著廣泛的投射。目前為止，已發(fā)現(xiàn)四種組胺受體H1、H2、H3、H4，其中H1R-H3R受體主要分布于大腦。組胺能夠通過(guò)H1R-H3R受體發(fā)揮多種神經(jīng)調(diào)節(jié)作用。目前有研究表明腦內(nèi)組胺與缺血后腦損傷有著密切的關(guān)系，在腦缺血?jiǎng)游锬Ｐ椭幸舶l(fā)現(xiàn)了腦內(nèi)組胺持續(xù)增高。同時(shí)更多研究表明，組胺合成酶組氨酸脫羧酶的抑制劑α-FMH可加重缺血晚期神經(jīng)元的損傷，

3、組胺前體物質(zhì)組氨酸可減少大鼠局灶性缺血后的腦梗死體積。以上證據(jù)提示腦內(nèi)組胺及其相關(guān)藥物可能對(duì)缺血性腦損傷具有保護(hù)作用。但是，由于外源性組胺無(wú)法透過(guò)血腦屏障，且其H1、H2受體的激活與外周的炎癥產(chǎn)生密切相關(guān)。因此，迫切希望找到能夠促進(jìn)腦內(nèi)組胺能神經(jīng)活性的藥物以治療腦缺血性神經(jīng)損傷。
　　組胺H3受體(H3R)是組胺能神經(jīng)元的自身受體，能夠負(fù)反饋參與調(diào)節(jié)組胺的合成與釋放。已有研究表明組胺H3R拮抗劑可以通過(guò)促進(jìn)組胺的合成和釋放來(lái)治療癲

4、癇、睡眠障礙、學(xué)習(xí)與記憶障礙等中樞神經(jīng)系統(tǒng)疾病。課題組前期研究也發(fā)現(xiàn)H3受體拮抗劑clobenpropit對(duì)于100μM NMDA誘發(fā)的神經(jīng)元損傷有明顯的保護(hù)作用;但是也有結(jié)果提示，H3受體激動(dòng)劑對(duì)10μM NMDA誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡也具有保護(hù)作用。因此，目前關(guān)于H3R對(duì)興奮性損傷的作用及機(jī)制還不清楚。本課題旨在研究H3R及其拮抗劑對(duì)缺血性腦損傷的作用及機(jī)制研究，可能使得H3R成為缺血性腦損傷治療的一個(gè)新靶點(diǎn)。
　　組胺H3受體拮抗劑

5、對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用及機(jī)制研究
　　在離體實(shí)驗(yàn)中，在體外培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元上，缺氧缺糖/再灌（OGD/R）誘導(dǎo)離體缺血損傷模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)OGD/R后，組胺H3R表達(dá)顯著上調(diào)。在轉(zhuǎn)染的H3R高表達(dá)的HEK293細(xì)胞，加重了血清剝奪誘導(dǎo)的細(xì)胞死亡。組胺H3R拮抗劑thioperamide能夠保護(hù)OGD/R誘導(dǎo)的神經(jīng)元死亡，該保護(hù)作用可被組胺H3R激動(dòng)劑immepip逆轉(zhuǎn)。另外，thioperamide可顯著降低OGD/R誘導(dǎo)

6、的TUNEL陽(yáng)性細(xì)胞凋亡以及cleaved caspase-3蛋白水平。在整體實(shí)驗(yàn)中，短暫性的小鼠大腦中動(dòng)脈阻塞(tMCAO)建立整體動(dòng)物缺血模型。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，三種組胺H3R拮抗劑(thioperamide，clobenpropit，A331440)均可顯著減輕tMCAO誘導(dǎo)的腦梗死體積。此外，H3R拮抗劑也可降低tMCAO誘導(dǎo)的細(xì)胞凋亡（TUNEL以及cleavedcaspase-3）。另外，與WT小鼠相比，H3R基因敲除(H3 R-/

7、-)小鼠能夠顯著減少tMCAO誘導(dǎo)的腦梗死體積以及細(xì)胞凋亡。更多結(jié)果表明，組胺H3R拮抗劑對(duì)缺血性腦損傷的神經(jīng)保護(hù)作用機(jī)制與其誘導(dǎo)的組胺上調(diào)無(wú)關(guān)。組胺H1R拮抗劑pyrilamine，組胺H2R拮抗劑cimetidine均不能逆轉(zhuǎn)thioperamide對(duì)腦缺血的神經(jīng)保護(hù)作用;給予組氨酸脫羧酶抑制劑α-FMH，thioperamide仍然具有神經(jīng)保護(hù)作用;組氨酸脫羧酶基因敲除(HDC-KO)小鼠上，thioperamide依然表現(xiàn)顯著的

8、對(duì)腦梗死的保護(hù)作用。
　　在體外培養(yǎng)的大鼠皮層神經(jīng)元上，OGD/R誘導(dǎo)組胺H3R下游Akt/GSK3β磷酸化水平顯著上調(diào)，thioperamide顯著降低了OGD/R誘導(dǎo)的Akt/GSK3β磷酸化水平上調(diào)。GSK3β活性抑制劑LiCl（上調(diào)GSK3β磷酸化水平）逆轉(zhuǎn)了thioperamide的對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用，表明H3R拮抗劑的神經(jīng)保護(hù)作用可能與其下游的Akt/GSK3β信號(hào)通路的磷酸化抑制有關(guān)。進(jìn)一步研究結(jié)果表明，thiope

9、ramide的對(duì)GSK3β的磷酸化抑制后還進(jìn)一步導(dǎo)致對(duì)其下游mTOR/P70S6K的抑制作用，進(jìn)而誘導(dǎo)自噬上調(diào)。在離體水平上，自噬抑制劑3-MA顯著逆轉(zhuǎn)了thioperamide的對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用;siRNA干擾自噬關(guān)鍵基因Atg7，thioperamide對(duì)神經(jīng)元的保護(hù)作用顯著降低;在自噬關(guān)鍵基因Atg5基因敲除的MEF細(xì)胞株上，thioperamide不具有保護(hù)OGD/R誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷作用。在整體水平上，3-MA顯著逆轉(zhuǎn)了thio

10、peramide的對(duì)腦梗死的減輕作用。更多研究結(jié)果表明，thioperamide的對(duì)自噬的上調(diào)的具體機(jī)制與跟H3R功能密切相關(guān)CLIC4蛋白有關(guān)。免疫共沉淀結(jié)果顯示，OGD/R誘導(dǎo)H3R-CLIC4蛋白之間相互作用加強(qiáng)，thioperamide降低了兩者之間的相互作用。使用多肽以及CLIC4的siRNA干擾方法模擬thioperamide的對(duì)H3R-CLIC4蛋白之間相互作用抑制作用，直接導(dǎo)致自噬水平的上調(diào)，因此，H3R-CLIC4蛋白