COX-2抑制劑對大鼠椎間盤退變影響的實驗研究.pdf

1、研究背景:在脊柱外科中，腰椎間盤退化性疾病是一種多發(fā)病和常見病。而在發(fā)生椎間盤退化時，會累及包括椎間盤、軟骨終板、關(guān)節(jié)突及黃韌帶等結(jié)構(gòu)都出現(xiàn)不同程度的退化性改變。以往對這方面的研究多集中于對髓核與纖維環(huán)上面，血管新生在退行性腰椎間盤疾病中研究不多，隨著研究的深入，血管新生在腰椎間盤退化性疾病中發(fā)揮著重要作用已經(jīng)得到一致的認同，然而在血管新生起到的作用則有兩種截然不同的說法，一者認為，血管新生能改善病變血運及營養(yǎng)是一種對病變的修復。另一說

2、法則認為，生理狀態(tài)下的椎間盤為無血供組織，而血管的侵入可能滿足了基質(zhì)金屬蛋白酶等基質(zhì)降解酶激活所需要的條件，從而導致基質(zhì)的降解，椎間盤發(fā)生退變。在過去研究中發(fā)現(xiàn)，COX-2在組織局部缺血缺氧時表達上調(diào)，并且其上調(diào)又能通過自身途徑影響新生血管的形成。本實驗首先建立大鼠腰椎退變模型，研究不同類型環(huán)氧化酶2(COX-2)抑制劑對椎間盤退變模型大鼠的影響，為椎間盤退變疾病的治療提供參考。
　　 隨著人口老齡化，脊柱的退行性病變已成為脊柱

3、外科的常見病，而腰椎間盤退變又是脊柱退行性病變中最為多發(fā)、最為常見的一個類型。臨床多表現(xiàn)為神經(jīng)根或脊髓壓迫后引起的腰疼、下肢放射疼、肌力降低、皮膚感覺異常及肌肉萎縮等。研究結(jié)果顯示，椎間盤的退行性改變是脊柱退行性變最先發(fā)生的部位。雖然至今為止椎間盤的這種退行性病變發(fā)生的機制仍未明確，但隨著近年來分子生物學的發(fā)展，對其機制的研究已經(jīng)不再局限于傳統(tǒng)力學因素，而是從分生角度及免疫角度去探討椎間盤退行變的成因，如細胞因子和炎癥介質(zhì)介導的髓核細胞

4、凋亡、椎間盤內(nèi)的蛋白多糖含量減少、新生血管的形成等都被普遍地認為在椎間盤退變的過程中發(fā)揮著十分重要的作用。新生血管形成在椎間盤退變過程中的作用，目前仍無定論，國內(nèi)外許多學者認為，椎間盤中新生血管的形成是椎間盤的一種保護機制，因椎間盤內(nèi)營養(yǎng)物質(zhì)主要來自上下終板及纖維環(huán)的被動擴散，而椎間盤退變開始后，營養(yǎng)物質(zhì)的被動擴散減弱，機體為了保證椎間盤內(nèi)的營養(yǎng)供應及修復退變的椎間盤，椎間盤內(nèi)代償性生成血管。但是，持反對觀點的學者們認為，本無血管的椎間

5、盤內(nèi)出現(xiàn)血管，使得椎間盤內(nèi)本來無活性的基質(zhì)降解酶原從血液中獲得激活的因子，從而使椎間盤的細胞外基質(zhì)發(fā)生降解，最終導致椎間盤發(fā)生退變?，F(xiàn)在有椎間盤新生血管的形成和盤內(nèi)蛋白多糖含量的降低及髓核細胞發(fā)生凋亡等研究學說。
　　 環(huán)氧化酶(COX)又稱前列腺素內(nèi)氧化酶還原酶，具有環(huán)氧化酶和過氧化氫酶活性，是一種雙功能酶，目前發(fā)現(xiàn)其有兩種同工酶:COX-1和COX-2。其中COX-2是誘導型蛋白，目前已證實其在多種惡性腫瘤內(nèi)血管形成過程中起

6、上調(diào)作用。此外，COX-2還是催化花生四烯酸轉(zhuǎn)化為前列腺素類物質(zhì)的限速酶。COX-2可通過多條途徑促進血管生成，如:上調(diào)VEGF、bel-2表達;血栓素A2、PGE2等這些由花生四稀酸代謝而來的產(chǎn)物，可促進血管內(nèi)皮細胞生長、遷移，誘導血管生成;此外，COX-2還可以抑制血管的內(nèi)皮細胞發(fā)生凋亡。應用選擇性的COX-2抑制劑可顯著地抑制腫瘤內(nèi)的血管生成。正常的椎間盤內(nèi)無血管生成，而退變的椎間盤新生血管則較常見。同時，許多研究證實COX-2因

7、子在退變的椎間盤內(nèi)表達較正常椎間盤內(nèi)表達明顯增高。
　　 缺氧誘導因子-1α(HIF-1α)是一種氧依賴轉(zhuǎn)錄激活因子，通過與低氧反應元件（HRE）結(jié)合，引發(fā)下游基因的轉(zhuǎn)錄。當哺乳動物的細胞中出現(xiàn)缺氧時，其可誘導機體產(chǎn)生適應性反應，是機體適應低氧環(huán)境的重要調(diào)節(jié)因子。椎間盤發(fā)生退變時，營養(yǎng)物質(zhì)通過終板與纖維環(huán)的能力就顯著降低，造成椎間盤內(nèi)部相對缺氧環(huán)境，近年來研究表明退變的椎間盤內(nèi)HIF-1α表達較正常椎間盤內(nèi)明顯增高，并且不同的缺

8、氧程度，表達情況不同。由于腫瘤組織生長十分迅速，其生長速度超過血管生成速度，使其形成局部缺氧環(huán)境，誘導HIF-1α表達。研究已經(jīng)證實，在腫瘤內(nèi)HIF-1α參與血管形成的全過程:(1)啟動階段，其能通過合成一氧化氮使血管舒張，上調(diào)血管內(nèi)皮生長因子及其配體的表達，使血管的通透性增加;(2)進展階段，其能增加金屬蛋白水解酶的表達，使細胞外基質(zhì)降解、使血管內(nèi)皮生長因子誘導血管的內(nèi)皮細胞發(fā)生增生與遷徙，在血管生成素-2的作用下，形成結(jié)節(jié)狀的或者錐

9、體狀的血管芽;(3)在形成階段，其在血管內(nèi)皮生長因子、血管生成素-1等的作用下，血管芽逐漸生長變形并形成血管腔，在和鄰近血管芽吻合成血管網(wǎng);(4)塑形與改造階段，其也能在血管生成素-1等的作用下，使血管壁的平滑肌和其他細胞發(fā)生遷移，包繞新生成的血管，從而形成完整壁結(jié)構(gòu)。
　　 研究表明COX-2、HIF-1a是腫瘤內(nèi)部新生血管形成的重要因子，而HIF-1a、則更是已經(jīng)被證明在人類椎間盤中表達，它們在退變椎間盤組織內(nèi)的表達以及與退

10、變椎間盤內(nèi)新生血管形成之間的關(guān)系，對于揭示退變椎間盤內(nèi)新生血管形成的機制、及對椎間盤退變的治療都有著重大的意義。
　　 研究目的:COX-2及HIF-1α在腫瘤內(nèi)表達明顯增加，并且腫瘤內(nèi)血管形成密切相關(guān)。在動物退變的椎間盤中有血管形成，而且許多學者認為，椎間盤內(nèi)血管形成是椎間盤退變的重要因素。同時先前研究也發(fā)現(xiàn)在退變的椎間盤內(nèi)COX-2和HIF-1α這兩種因子的表達較正常椎間盤明顯增高，探討不同類型COX-2抑制劑對椎間盤退變模

11、型大鼠的影響，為椎間盤退變疾病的治療提供參考。
　　 研究方法:選擇12月齡SPF級SD大鼠60只，首先建立腰椎間盤退變動物模型，所有大鼠均采用6.5％水合氯醛腹腔注射麻醉，取俯臥位，固定四肢，腰背部備皮，消毒鋪單，沿腰背部棘突做后正中切口，切開皮膚后沿骨膜下剝離，咬骨鉗去除以L3為中心的L1～S1棘突、關(guān)節(jié)突和棘上、棘間韌帶，切斷雙側(cè)豎棘肌，然后逐層縫合皮下筋膜、皮膚，放入單獨籠中飼養(yǎng)。采用簡單隨機法分為4組，每組15只:對照

12、組采用安慰劑10mg·kg-1·d-1灌胃給藥，塞來昔布組采用塞來昔布膠囊10mg·kg-1·d-1灌胃給藥，尼美舒利組采用尼美舒利顆粒10mg·kg-1·d-1灌胃給藥，雙藥組采用塞來昔布膠囊5mg·kg-1·d-1和尼美舒利顆粒5mg·kg-1·d-1灌胃給藥，共飼喂8周。檢測各組大鼠缺氧誘導因子1α(HIF-1α)和血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)表達情況，椎間盤組織蛋白多糖的水平，計算軟骨細胞凋亡指數(shù)（AI）。
　　 研究結(jié)

13、果:
　　 1、對照組大鼠HIF-1α和VEGF均呈陽性表達，表現(xiàn)為胞質(zhì)、胞核黃染，其它各組則陰性、陽性均有表達，混合用藥組作用更為明顯。各組大鼠HIF-1α、VEGF陽性表達情況比較，差異均有統(tǒng)計學意義。
　　 2、僅使用安慰劑喂養(yǎng)的對照組別中，在椎間盤髓核細胞中HIF-1α出現(xiàn)高表達，當使用COX-2抑制劑進行干預后，HIF-1α的表達有所下降，聯(lián)合用藥作用更為明顯。同時對VEGF蛋白的表達進行探討，VEGF在對照組

14、中的蛋白表達顯著上升，當使用COX-2抑制劑進行干預后，VEGF表達下降，同樣是聯(lián)合用藥作用更為明顯。
　　 3、對照組蛋白多糖的水平為（1.31±0.02）pg/mg，而骨細胞凋亡指數(shù)（AI）則為（43.81±2.88）;尼美舒利組為（2.06±0.06）pg/mg、(27.67±2.08);塞來昔布組為（2.19±0.10）pg/mg、（28.67±0.58）;而雙藥組則為(2.62±0.10)pg/mg、（23.67±1.

15、53）?？梢?，用藥組的蛋白多糖水平明顯上升，而骨細胞凋亡指數(shù)(AI)則明顯下降，另外，混合用藥組作用更為明顯，經(jīng)分析，其差異均具有統(tǒng)計學意義。
　　 4、對不同組別的椎間盤退變模型進行蛋白多糖含量的檢測，發(fā)現(xiàn)對照組的蛋白多糖丟失最為嚴重，當喂養(yǎng)時加入了不同濃度的COX-2抑制劑后，蛋白多糖丟失相對減輕，聯(lián)合用藥的減輕效果更為明顯;另外，通過對組織進行TUNEL染色，發(fā)現(xiàn)對照組出現(xiàn)凋亡現(xiàn)象最為顯著，在加以COX-2抑制劑后，凋亡現(xiàn)

16、象減輕，同樣也是聯(lián)合用藥的減輕效果更為明顯。
　　 研究結(jié)論:
　　 1、所謂退行性變就是構(gòu)成椎間盤的組織成分，在各種因素影響下出現(xiàn)生物化學反應，使這些組織成分在性質(zhì)、數(shù)目以及形態(tài)結(jié)構(gòu)方面發(fā)生變化，最終導致功能減退或喪失的現(xiàn)象。在椎間盤退變發(fā)生時，往往會伴有著缺氧及新生血管現(xiàn)象的出現(xiàn)。
　　 2、新生血管的形成對于椎間盤退行性變有著重要的作用，而經(jīng)大量研究表明，COX-2因子與新生血管的形成也密切相關(guān)。當對COX

17、-2進行抑制時，都對椎間盤退變有著良好的治療效果。而COX-2因子主要是通過刺激椎間盤中毛細血管增生而參與椎間盤退變的過程。
　　 3、本研究結(jié)果證實，使用COX-2抑制劑對COX-2進行抑制，都可以有效緩解椎間盤退變的癥狀，臨床效果顯著。當聯(lián)合COX-2抑制劑進行抑制時，治療效果更為明顯，各抑制劑之間具有一定的協(xié)同作用。
　　 4、研究發(fā)現(xiàn)，沒有使用COX-2抑制劑的組別的蛋白多糖丟失以及細胞凋亡均最為嚴重，當喂養(yǎng)時加