驅(qū)動蛋白Kif2a在乳腺癌中表達(dá)的臨床意義及功能研究.pdf

1、乳腺癌是嚴(yán)重威脅世界女性健康的惡性腫瘤，其發(fā)病率逐年增加，據(jù)統(tǒng)計，2008年，美國40，000女性死于乳腺癌。在亞洲和許多發(fā)展中國家，女性乳腺癌的發(fā)病率逐年增加。乳腺癌已經(jīng)成為東南亞女性死亡的主要原因，乳腺癌是年齡在40～79歲之間的女性死亡的最主要原因。在東亞女性中，已經(jīng)成為僅次于胃癌的第二大惡性腫瘤。在我國，乳腺癌的發(fā)病率和死亡率呈明顯上升趨勢，并且上升的速度已經(jīng)超過了世界平均上升速度。在中國的部分城市如北京、上海等地方，乳腺癌已經(jīng)

2、成為女性死亡率最高的疾病，而乳腺癌的發(fā)病原因至今仍不十分明確。20世紀(jì)90年代人們發(fā)現(xiàn)了微管驅(qū)動蛋白，這些蛋白在細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)運(yùn)、分裂和雙極紡錘體形成中有極其重要的作用。最近發(fā)現(xiàn)，某些驅(qū)動蛋白與腫瘤發(fā)生、發(fā)展有關(guān)。驅(qū)動蛋白-13家族中Kif2c/MCAK與腫瘤的關(guān)系已有報道，但驅(qū)動蛋白Kif2a在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展中的作用及與預(yù)后的關(guān)系至今尚無研究報道。本課題分為三部分，從不同方面分別對Kif2a與乳腺癌的關(guān)系進(jìn)行研究：
　　 第一部

3、分驅(qū)動蛋白Kif2a在乳腺癌中表達(dá)的臨床意義
　　 研究目的：
　　 通過檢測驅(qū)動蛋白Kif2a及其mRNA在乳腺癌和癌旁組織中的表達(dá)情況，探討Kif2a與乳腺癌臨床病理特點(diǎn)的關(guān)系，為探索Kif2a與乳腺癌發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后的關(guān)系提供參考。
　　 研究方法：
　　 1.病例資料收集
　　 以1997和2009年間在山東大學(xué)齊魯醫(yī)院乳腺外科接受乳腺癌根治術(shù)或改良根治術(shù)的116例原發(fā)性乳腺癌病人作為研究

4、對象(1997年60例，2009年56例)。本組116例病人均為女性，發(fā)病年齡20～65歲，中位年齡45歲，所有病例術(shù)前均未接受放射治療、化療以及內(nèi)分泌治療。1997年手術(shù)的60例病例隨訪時間超過10年。
　　 2.免疫組化染色
　　 對116例乳腺癌和癌旁組織進(jìn)行Kif2a常規(guī)免疫組化染色。結(jié)果分析采用改良的Harvey評分標(biāo)準(zhǔn)。
　　 3.Real time RT-PCR檢測
　　 在留取乳腺癌和癌旁

5、組織做石蠟包埋的同時，分別各取部分新鮮的癌和癌旁組織迅速放入-196℃液氮中保存，統(tǒng)一提取總RNA，進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和DNA擴(kuò)增，檢測mRNA表達(dá)情況。
　　 4.統(tǒng)計學(xué)分析
　　 用SPSS16.0統(tǒng)計軟件包進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩均數(shù)間比較采用t檢驗(yàn)。用log-rank檢驗(yàn)分析Kif2a表達(dá)與生存時間的關(guān)系，P<0.05為有顯著性差異。
　　 結(jié)果：
　　 1.Kif2a在原發(fā)乳腺癌組

6、織中表達(dá)高于癌旁組織
　　 驅(qū)動蛋白Kif2a免疫組化染色定位于腫瘤細(xì)胞漿和細(xì)胞核中，68.2％的病例中乳腺癌細(xì)胞Kif2a表達(dá)高于癌旁組織上皮細(xì)胞，評分分別為7.0517±0.74419和6.2931±0.97817，原發(fā)癌組織與癌旁組織表達(dá)水平在統(tǒng)計學(xué)上有顯著差異(P<0.05)。
　　 2.乳腺癌組織中Kif2a的mRNA表達(dá)高于癌旁組織
　　 檢測4對原發(fā)癌和癌旁組織中Kif2a的mRNA，同時檢測癌和癌

7、旁組織蛋白水平的表達(dá)，結(jié)果顯示：原發(fā)癌組織中Kif2a的mRNA表達(dá)水平高于癌旁組織，與免疫組化檢測的原發(fā)癌和癌旁組織Kif2a蛋白表達(dá)結(jié)果一致。
　　 3.Kif2a在乳腺癌組織中過表達(dá)與臨床病理特點(diǎn)的相關(guān)性
　　 本組116例病人中，原發(fā)癌組織中Kif2a表達(dá)水平與腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有關(guān)，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的原發(fā)癌組織中Kif2a的表達(dá)評分分別為：7.3043±0.6486和6.6809±0.7255，

8、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的原發(fā)癌組織中Kif2a表達(dá)高于腋窩淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患者(P<0.05)。但是，Kif2a的表達(dá)水平與病人的年齡、腫瘤大小、病理學(xué)分期無關(guān)(P>0.05)。
　　 4.乳腺癌組織中Kif2a的表達(dá)水平與病人生存率相關(guān)
　　 本組116例乳腺癌病人中，60例病人的隨訪時間超過10年。隨訪結(jié)果顯示：Kif2a的表達(dá)與患者預(yù)后有關(guān)。Kif2a蛋白高表達(dá)病人的10年生存率是51.1％，低表達(dá)的生存率是93.3％，高

9、表達(dá)與低表達(dá)兩組之間的生存率有顯著差異(P<0.05)。乳腺癌伴有肝臟、肺臟或骨轉(zhuǎn)移的患者，原發(fā)癌組織中Kif2a的評分都較高。
　　 結(jié)論：
　　 1.乳腺癌組織中的Kif2a在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)均高于相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)。
　　 2.乳腺癌組織中Kif2a蛋白的表達(dá)與病人的年齡、病理學(xué)組織分級、腫瘤大小無關(guān)，與患者有無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的原發(fā)癌組織中Kif2a表達(dá)高于腋窩淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移患

10、者。
　　 3.乳腺癌組織中Kif2a蛋白的表達(dá)與預(yù)后相關(guān)，Kif2a高表達(dá)者生存率遠(yuǎn)低于低表達(dá)者。
　　 第二部分轉(zhuǎn)染Kif2a-siRNA乳腺癌MCF-7細(xì)胞惡性行為的影響
　　 研究目的：
　　 通過siRNA干擾方法，沉默乳腺癌MCF-7細(xì)胞中的Kif2a基因，檢測乳腺癌MCF-7細(xì)胞在增殖、凋亡、遷移以及侵襲能力方面的變化，探討Kif2a在乳腺癌細(xì)胞增殖、凋亡、遷移以及侵襲中的作用，為探索以Ki

11、f2a為新靶點(diǎn)的乳腺癌生物靶向治療提供參考依據(jù)。
　　 研究方法：
　　 1.轉(zhuǎn)染Kif2a-siRNA
　　 根據(jù)siRNA轉(zhuǎn)染說明進(jìn)行轉(zhuǎn)染。將乳腺癌MCF-7細(xì)胞(2×105/孔)接種于6孔板中，孵育16小時后，融合率達(dá)30～50％時，將5μlKif2a的siRNA和200μlOPTI-MEM混合，然后與5μ l脂質(zhì)體lipofectamine2000和200μ l OPTI-MEM的混合物混勻，加入每個孔，

12、使每孔的Kif2a劑量為50nM/2ml，在37℃，5％CO2條件下培養(yǎng)4-6小時后，將培養(yǎng)基換成含10％胎牛血清的RPMI1640分別繼續(xù)培養(yǎng)至24小時、48小時和72小時。
　　 2.MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制
　　 MTT法檢測乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖情況。將MCF-7細(xì)胞接種于平底96孔板中(1.0×103/孔)，設(shè)空白對照組、轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA組和轉(zhuǎn)染特異性Kif2a-siRNA組三組細(xì)胞，分別培養(yǎng)24小時

13、、48小時和72小時。加入MTT試劑，繼續(xù)孵育4小時，離心，棄上清，加入150μl DMSO上酶標(biāo)儀比色，用570nm-620nm波長測光吸收值，計算抑制率。
　　 3.細(xì)胞遷移檢測
　　 在孔徑為8.0-μ m Transwell小室下室加入600μ l10％胎牛血清RPMI1640培養(yǎng)液，上室加入2×104cells/100μ l細(xì)胞懸液。放置于5％CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱內(nèi)，37℃、飽和濕度環(huán)境下孵育16小時；甲醇固定10

14、分鐘；伊紅染色劑染色；200倍光鏡下，計數(shù)微孔濾膜下室面遷移的腫瘤細(xì)胞，每張膜隨機(jī)計數(shù)10個視野。取平均值作為遷移細(xì)胞數(shù)量。
　　 4.細(xì)胞侵襲檢測
　　 在Transwell小室上室的底部鋪Matrigel膠40μl，細(xì)胞穿孔時間延長至24小時。其他實(shí)驗(yàn)要求和方法同遷移實(shí)驗(yàn)。
　　 5.流式細(xì)胞技術(shù)檢測凋亡
　　 收集空白對照組、轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA組和轉(zhuǎn)染特異性Kif2a-siRNA組細(xì)胞，用10

15、0μl稀釋結(jié)合緩沖液重新懸浮細(xì)胞，加5μ lAnexinV/FITC和10μ l(10μg/ml)碘化丙啶溶液?；靹蚝笥谑覝乇芄夥跤?5min。在反應(yīng)管中加400μ l稀釋結(jié)合緩沖液，過濾后上流式細(xì)胞儀分析。
　　 結(jié)果：
　　 1.沉默Kif2a后乳腺癌MCF-7細(xì)胞增殖受抑制
　　 空白對照組、轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA組和Kif2a-siRNA組分別培養(yǎng)24、48和72小時，OD值分別如下，24小時：0.41

16、98±0.0616(mock)，0.4076±0.0439(nonsense-siRNA)，0.2864±0.0230(Kif2a-siRNA)，48小時：0.7287±0.1318(mock)，0.7019±0.0523(nonsense-siRNA)，0.5054±0.1011(Kif2a-siRNA)；72小時：0.7948±0.0668(mock)，0.6689±0.0951(nonsense-siRNA)，0.4745±0.0

17、849(Kif2a-siRNA)。結(jié)果顯示：24、48、72小時兩組對照組與實(shí)驗(yàn)組比較，抑制率有顯著性差異，均P<0.05。但24、48和72小時空白對照和轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA組間比較，無顯著性差異(P>0.05)。乳腺癌MCF-7細(xì)胞轉(zhuǎn)染Kif2a-siRNA后，細(xì)胞增殖生長明顯受抑制。
　　 2.沉默Kif2a基因乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移能力下降
　　 用Transwell小室，檢測乳腺癌MCF-7細(xì)胞沉默Kif

18、2a后對遷移能力的影響。16小時的遷移能力實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：與空白對照和轉(zhuǎn)染無意義序列siRNA對照組相比，敲除Kif2a基因的乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移能力顯著降低(P<0.05)，這與本研究的第一部分臨床資料的研究結(jié)果相吻合，即乳腺癌患者Kif2a的高表達(dá)與患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。
　　 3.沉默Kif2a基因乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力下降
　　 Transwell小室上室底部鋪40μ l Matrigel膠，

19、檢測沉默Kif2a后乳腺癌MCF-7細(xì)胞的侵襲能力，侵襲實(shí)驗(yàn)的侵襲時間為24小時。與空白對照和無意義序列siRNA對照組相比，敲除Kif2a基因的乳腺癌MCF-7細(xì)胞侵襲能力顯著降低(P<0.05)，這也與本研究的第一部分臨床資料的研究結(jié)果相吻合，即乳腺癌患者Kif2a的高表達(dá)與患者的腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。
　　 4.沉默Kif2a基因?qū)θ橄侔㎝CF-7細(xì)胞凋亡無明顯影響
　　 本研究中，我們選用AnexinV/F

20、ITC法檢測轉(zhuǎn)染Kif2a-siRNA后24、48和72小時的晚期細(xì)胞凋亡率，流式細(xì)胞儀分析結(jié)果為24小時：6.89％±3.48％(mock)，6.91％±3.60％(Kif2a-siRNA)；48小時：9.51％±3.14％(mock)，16.65％±5.5212％(Kif2a-siRNA)：72小時：9.32％±5.34％(mock)，13.88％±5.65％(Kif2a-siRNA)。轉(zhuǎn)染Kif2a-siRNA的乳腺癌細(xì)胞凋亡率與

21、對照組比較無顯著性差異(P>0.05)，未發(fā)現(xiàn)Kif2a-siRNA轉(zhuǎn)染對乳腺癌細(xì)胞的凋亡有影響。
　　 結(jié)論：
　　 1.沉默Kif2a基因后乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖能力明顯降低。
　　 2.沉默Kif2a基因后乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲能力明顯降低。與本研究的第一部分臨床資料的研究結(jié)果相吻合，即乳腺癌患者Kif2a的高表達(dá)與患者有無腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移有顯著相關(guān)性。
　　 3.沉默Kif2a基因后對

22、乳腺癌MCF-7細(xì)胞的凋亡無明顯影響。
　　 第三部分驅(qū)動蛋白Kif2a與癌胚抗原黏附分子CEACAM1在乳腺癌組織中表達(dá)以及與預(yù)后的關(guān)系
　　 研究目的：
　　 通過同時檢測Kif2a和癌胚抗原相關(guān)細(xì)胞黏附分子1(CEACAM1)在乳腺癌和癌旁組織中的表達(dá)，探討Kif2a與CEACAM1表達(dá)的相關(guān)性，明確驅(qū)動蛋白Kif2a與癌胚抗原相關(guān)黏附分子CEACAM1在乳腺癌中的作用及與預(yù)后的關(guān)系。
　　 研究方

23、法：
　　 選取隨訪資料完整的60例乳腺癌病人為研究對象，用免疫組化方法檢測60例乳腺癌原發(fā)腫瘤及癌旁組織中Kif2a和CEACAM1的表達(dá)。統(tǒng)計分析與生存率的關(guān)系。
　　 研究結(jié)果：
　　 1.驅(qū)動蛋白Kif2a在乳腺癌組織中的表達(dá)高于相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)免疫組織化學(xué)方法檢測60例乳腺癌樣本及相應(yīng)的癌旁組織。結(jié)果顯示，57％(34/60)病例中癌組織Kif2a表達(dá)高于癌旁組織，癌旁組織Kif2a表達(dá)明顯低于癌組

24、織，原發(fā)乳腺癌組織與癌旁組織中Kif2a表達(dá)有顯著性差異(P<0.05)。
　　 2.CEACAM1在乳腺癌組織中的表達(dá)低于相應(yīng)癌旁組織中的表達(dá)
　　 免疫組織化學(xué)檢測60例乳腺癌樣本及相應(yīng)的癌旁組織。結(jié)果顯示，65％(39/60)的原發(fā)癌組織CEACAM1表達(dá)低于癌旁組織，癌旁組織CEACAM1表達(dá)明顯高于癌組織(P<0.05)。
　　 3.驅(qū)動蛋白Kif2a與癌胚抗原相關(guān)黏附分子CEACAM1在乳腺癌組織中表

25、達(dá)的相關(guān)性
　　 驅(qū)動蛋白Kif2a在乳腺癌組織中的表達(dá)與CEACAM1在乳腺癌組織中表達(dá)進(jìn)行對比研究，結(jié)果顯示：P<0.05，R=-0.295，兩者有相關(guān)性，癌組織中Kif2a和CEACAM1的表達(dá)水平兩者呈負(fù)相關(guān)，Kif2a表達(dá)越高CEACAM1表達(dá)越低，反之亦然。
　　 4.癌胚抗原相關(guān)黏附分子CEACAM1在乳腺癌組織中表達(dá)與生存率有關(guān)
　　 本組60例病人從手術(shù)日起計算，5年生存率為85％(51/60)

26、，10年生存率為65％(39/60)。在CEACAM1呈中、高表達(dá)的病例中，10年生存率80％，低表達(dá)或不表達(dá)病例中，10年生存44％。CEACAM1呈中、高表達(dá)組的生存率明顯高于低表達(dá)或不表達(dá)組。CEACAM1表達(dá)與病人年齡、腫瘤大小、腫瘤病理分級和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移無關(guān)(P>0.05)。
　　 結(jié)論：
　　 1.Kif2a在乳腺癌組織中呈高表達(dá)，癌旁組織相對低表達(dá)；相反，癌組織中CEACAM1低表達(dá)，癌旁組織高表達(dá)。

27、　　 2.Kif2a和CEACAM1兩者在癌組織中的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，乳腺癌組織中Kif2a表達(dá)越高，CEACAM1表達(dá)越低。相反，乳腺癌組織中Kif2a表達(dá)越低，CEACAM1表達(dá)越高。
　　 3.乳腺癌組織中Kif2a和CEACAM1表達(dá)都與預(yù)后相關(guān)，Kif2a表達(dá)上調(diào)、CEACAM1表達(dá)下調(diào)或不表達(dá)的病人預(yù)后差，聯(lián)合檢測Kif2a和CEACAM1可望成為預(yù)測乳腺癌預(yù)后的重要因子。
　　 1.本課題首次檢測了乳腺癌原發(fā)

28、腫瘤和癌旁組織中Kif2a的表達(dá)情況，通過臨床病理資料分析、10年以上的隨訪，闡述了Kif2a的表達(dá)與病人轉(zhuǎn)移和預(yù)后的相關(guān)性。
　　 2.本課題首次通過應(yīng)用siRNA干擾技術(shù)、體外細(xì)胞功能實(shí)驗(yàn)，從細(xì)胞增殖、遷移、侵襲等方面全面、深入地探討了Kif2a，在乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展及預(yù)后中的作用。
　　 3.本課題首次研究癌基因Kif2a和抑癌基因CEACAM1在同一乳腺癌組織中的表達(dá)及兩者之間的表達(dá)關(guān)系，聯(lián)合檢測乳腺癌Kif2a