Pin1抑制劑對小鼠植入前胚體外發(fā)育和ERα蛋白表達(dá)的影響.pdf

1、目的:
　　觀察Pin1在小鼠植入前胚中的定位分布及其抑制劑（Juglone）對小鼠植入前胚體外發(fā)育的影響；研究Pin1受抑制后，對干細(xì)胞因子mRNA表達(dá)和ERα蛋白表達(dá)的影響；為進(jìn)一步闡明Pin1在合子基因組激活中的作用機(jī)制提供理論依據(jù)。
　　方法：
　　1.分別獲取KM雌性小鼠與雄性小鼠（♀KM×♂KM）交配所得不同生長階段的植入前胚，包括卵母細(xì)胞（不交配）、1-細(xì)胞胚、2-細(xì)胞胚、4-細(xì)胞胚、8-細(xì)胞胚、桑葚胚以

2、及囊胚。通過免疫熒光檢測技術(shù)（immunofluorescence technique，IF），檢測Pin1在以上各階段植入前胚中的定位分布；
　　2.獲取KM雌性小鼠與雄性小鼠（♀KM×♂KM）交配所得1-細(xì)胞胚，將其置于KSOM培養(yǎng)液及添加有不同溶度Juglone的培養(yǎng)液中進(jìn)行體外培養(yǎng)，并觀察小鼠植入前胚體外發(fā)育情況；
　　3.收集體外發(fā)育至2-細(xì)胞胚（hCG后45h）的植入前胚，利用Realtime-PCR檢測KSOM

3、組和Juglone（25?M）組中Sox2、Oct4、c-Myc和Klf4四個(gè)干細(xì)胞因子mRNA的表達(dá)水平；
　　4．分別獲取KM雌性小鼠與雄性小鼠（♀KM×♂KM）交配所得處于細(xì)胞周期間期及分裂期的1-細(xì)胞胚和2-細(xì)胞胚，通過免疫熒光檢測技術(shù)（IF），檢測Pin1和ER?在以上階段植入前胚中的定位分布；
　　5.收集體外發(fā)育至2-細(xì)胞胚（hCG后45h）的植入前胚，利用免疫熒光檢測KSOM組和Juglone（25μM）組中

4、胚內(nèi)pan-ER?和pERα-S118定位和表達(dá)情況。
　　結(jié)果:
　　1.免疫熒光結(jié)果顯示，在卵母細(xì)胞和各發(fā)育階段的植入前胚中都存在Pin1蛋白，且細(xì)胞胞質(zhì)和胞核內(nèi)均有分布，從1-細(xì)胞胚開始，細(xì)胞核內(nèi)Pin1熒光著色更為明顯；
　　2．Pin1抑制劑（Juglone）作用植入前胚體外發(fā)育全程（hCG后27h至120h），Juglone（10Mμ和25μM）可使1-細(xì)胞胚發(fā)育阻滯于2-細(xì)胞胚，并且極少能過渡至4-細(xì)胞胚

5、(P<0.01)；Pin1抑制劑（Juglone）作用18h（hCG后27h至45h），Juglone（25μM）可使1-細(xì)胞胚發(fā)育阻滯于2-細(xì)胞胚，并且很少能過渡至4-細(xì)胞胚(P<0.01)。
　　3.Realtime-PCR結(jié)果顯示，Juglone（25μM）組中，Sox2 mRNA表達(dá)水平明顯低于KSOM組（P<0.05），而Klf4、c-Myc和Oct4 mRNA表達(dá)量相較KSOM組無明顯差別（P<0.05）。
　　

6、4.免疫熒光結(jié)果顯示，在1-細(xì)胞胚至2-細(xì)胞胚時(shí)期，Pin1與ERα蛋白隨著細(xì)胞周期進(jìn)程的定位分布，有著相同的變化。
　　5. Juglone（25μM）組中，2-細(xì)胞胚內(nèi)pan-ERα熒光相對強(qiáng)度與KSOM組比較無明顯差別（P>0.05）。2-細(xì)胞胚內(nèi)pER?-S118熒光相對強(qiáng)度高于KSOM組（P<0.01）。
　　結(jié)論：
　　Pin1抑制劑（Juglone）對2-細(xì)胞胚至4-細(xì)胞胚體外發(fā)育過渡具有明顯的抑制作用，