mir-92a調(diào)控KLF4表達影響結(jié)直腸癌細胞增殖的機制研究.pdf

1、[目的]
　　本研究旨在研究miR-92a在結(jié)直腸癌組織和細胞系中的表達水平，探討其影響腫瘤細胞增殖的生物學(xué)功能及其分子調(diào)控機制，以期為結(jié)直腸癌的分子靶向藥物治療和預(yù)后評估提供一定的實驗依據(jù)。
　　[方法]
　　1.采用實時熒光定量PCR技術(shù)對8對結(jié)直腸癌和癌旁正常組織、4種結(jié)腸癌細胞系的miR-92a表達水平進行檢測，研究miR-92a在結(jié)直腸癌中的表達情況。
　　2.選擇miR-92a表達最低和最高的兩株結(jié)腸

2、癌細胞系HCT116和SW620，對應(yīng)瞬時轉(zhuǎn)染miR-92a-3p mimic和miR-92a-3p inhibitor，構(gòu)建促進miR-92a表達和抑制miR-92a表達的細胞模型。并通過CCK8比色法檢測細胞增殖、克隆形成和流式檢測細胞周期實驗，探討miR-92a對結(jié)直腸癌細胞增殖的影響。
　　3.運用軟件Targetscan6.2對miR-92a的下游靶基因進行預(yù)測分析。選擇miR-92a可能的調(diào)控靶基因KLF4進行研究，采

3、用免疫印跡法檢測miR-92a高表達和抑制表達的細胞模型中KLF4的表達水平，探討miR-92a與KLF4表達的相關(guān)性。
　　4.構(gòu)建pEZX-MT01-KLF43'UTR野生型(WT)及突變型(Mut)雙熒光素酶報告質(zhì)粒，與miR-92a-3p mimic及miR-92a-3p mimic negative control共轉(zhuǎn)染HCT116,探討miR-92a與KLF43'UTR的直接靶向結(jié)合作用。
　　5.采用免疫印跡法

4、檢測8例臨床結(jié)直腸癌組織樣本KLF4蛋白表達水平，分析CRC組織miR-92a表達水平與KLF4蛋白表達的關(guān)系。
　　[結(jié)果]
　　1.癌組織(T)中miR-92a的表達水平為（1.294±0.957）fmol/μg total RNA，明顯高于配對癌旁正常組織（TAT）(0.045±0.027) fmol/μg total RNA(P＜0.05)，其相對比值T/TAT為31.94±29.717倍;與內(nèi)鏡下取得正常結(jié)腸上皮粘

5、膜組織比較，4種人結(jié)腸癌細胞系HT29，SW480，SW620和HCT116中miR-92a的表達水平均顯著高于正常對照組（P＜0.05）。
　　2.對HCT116和SW620對應(yīng)轉(zhuǎn)染miR-92a-3p mimic和miR-92a-3p inhibitor后，HCT116中miR-92a的表達較陰性對照組顯著升高，而SW620中miR-92a的表達較陰性對照組顯著降低(P＜0.05)。HCT116轉(zhuǎn)染miR-92a-3p mim

6、ic后，miR-92a高表達，其細胞增殖活性、克隆形成的數(shù)量均明顯高于對照組(P＜0.05);SW620轉(zhuǎn)染miR-92a-3p inhibitor后，miR-92a抑制表達，細胞增殖活性、克隆形成的數(shù)量均明顯少于對照組(P＜0.05)。采用流式檢測細胞周期，miR-92a高表達時，S期細胞增多（P＜0.01）;miR-92a表達抑制后，G0/G1期細胞增多，S期細胞減少(P＜0.05)。
　　3.Targetscan6.2預(yù)測顯

7、示miR-92a的種子序列與KLF4的3'UTR之間存在靶向結(jié)合位點。轉(zhuǎn)染miR-92a-3p mimic后，HCT116細胞miR-92a的表達水平顯著升高，其KLF4蛋白表達水平下降40.89％;轉(zhuǎn)染miR-92a-3p inhibitor后，SW620細胞miR-92a的表達水平顯著下降，其KLF4蛋白表達水平升高52.68％，差異均具有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.05)，miR-92a的表達水平與KLF4的蛋白表達負相關(guān)。
　　4

8、.miR-92a-3p mimic與pEZX-MT01-KLF43'UTR野生型或突變型雙熒光素酶報告質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染HCT116細胞，與陰性對照比較，上調(diào)細胞miR-92a表達能使Firefly熒光素酶活性略有降低，但無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。
　　5.8例臨床結(jié)直腸癌組織中miR-92a水平與KLF4蛋白表達之間有一定的負相關(guān)趨勢，r=-0.136，P=0.748，相關(guān)性不顯著。
　　[結(jié)論]
　　miR-92a在結(jié)