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文檔簡介
1、目的:
研究miR-30a對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移的影響并初步探討其可能的分子機(jī)制。
方法:
1.miR-30a的相對表達(dá)量
采用莖環(huán)實(shí)時熒光定量 PCR技術(shù)檢測不同轉(zhuǎn)移能力的結(jié)直腸癌細(xì)胞株中miR-30a的相對表達(dá)量,初步分析其與結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移是否相關(guān)。
2.miR-30a對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移的影響
1)構(gòu)建pre-miR-30a過表達(dá)的慢病毒顆粒,并感染miR-30a表達(dá)量
2、較低的SW620。熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染情況,實(shí)時熒光定量PCR檢測轉(zhuǎn)染效率。
2)利用劃痕實(shí)驗(yàn)檢測過表達(dá)miR-30a后SW620的遷移特性,Transwell小室侵襲實(shí)驗(yàn)檢測其侵襲性。
3.miR-30a抑制結(jié)直腸癌侵襲遷移的分子機(jī)制
1)miR-30a作用靶點(diǎn)的預(yù)測以has-miR-30a為檢索詞,利用數(shù)據(jù)庫Targetscan、miRanda(microRNA.org)、miRDB對miR-30a進(jìn)行靶
3、基因的預(yù)測,挑選軟件交集較多以及預(yù)測值較高的作為靶點(diǎn),即AEG-1/MTDH作為研究對象。
2)Western blot檢測過表達(dá)miR-30a后AEG-1/MTDH蛋白表達(dá)水平,實(shí)時熒光定量PCR技術(shù)檢測相應(yīng)AEG-1/MTDHmRNA的相對表達(dá)量。
4.統(tǒng)計學(xué)分析
采用SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析,實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)均以均值±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示,采用兩組獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間差異的比較,采用單因素方差分
4、析進(jìn)行多組計量間資料比較,采用LSD-t檢驗(yàn)進(jìn)行兩組間資料的比較,檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。
結(jié)果:
1.相對于SW480(1.00±0.00)而言,miR-30a在Caco2中的相對表達(dá)量為0.88±0.084,差異沒有統(tǒng)計學(xué)意義(t=2.547,p=0.126);在轉(zhuǎn)移性細(xì)胞系(HT-29、HCT116和SW620)中的相對表達(dá)量均顯著降低,分別是0.74±0.081;0.37±0.055;0.29±0.040,差異
5、均具有統(tǒng)計學(xué)意義(t HT-29=5.600,P=0.030;t HCT-116=19.92, p=0.002;t SW620=30.74,p=0.001)其中在高度惡性的SW620細(xì)胞系中表達(dá)最低。
2.生物學(xué)軟件分析miR-30a可能的靶點(diǎn)是AEG-1/MTDH;在SW620中轉(zhuǎn)染pre-miR-30a后AEG-1/MTDHmRNA和蛋白的表達(dá)量明顯下降,差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。
結(jié)論:
1.miR-30a
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