含二氮嗪與1，6-二磷酸果糖心麻痹液對(duì)離體大鼠心臟低溫保存的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、心臟移植作為終末期心臟疾病的治療方法已被廣泛接受，而高質(zhì)量的心臟保存是提高手術(shù)成功率及遠(yuǎn)期生存率的重要環(huán)節(jié)。目前臨床上普遍采用的單純低溫浸泡方法安全保存心臟的時(shí)限一般在4-6h，因此心臟保存液及保存方法仍需不斷改進(jìn)。心臟保存必須解決兩個(gè)問(wèn)題，一是減少保存期間的能量消耗，增加能量供應(yīng)，維持心肌能量?jī)?chǔ)備；二是減輕移植后缺血再灌注損傷。 研究發(fā)現(xiàn)，線粒體ATP敏感的K+通道(mitKATP)既是心肌保護(hù)的始動(dòng)因素又是其效應(yīng)器，MitK

2、ATP開(kāi)放劑二氮嗪(DZ)對(duì)心肌缺血再灌注具有保護(hù)作用。1，6-二磷酸果糖(FDP)是細(xì)胞在糖酵解途徑中產(chǎn)生的一個(gè)重要中間產(chǎn)物，可為缺氧的組織細(xì)胞提供能量來(lái)源，減輕缺氧對(duì)心肌細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞的損害，有助于低溫保存后心臟功能的恢復(fù)。目前移植器官的保存方法主要有單純低溫浸泡和持續(xù)微量灌注二種，實(shí)驗(yàn)證明，持續(xù)微量灌注較單純低溫浸泡能更有效地延長(zhǎng)離體器官的保存時(shí)間。由此，我們推論附加DZ與FDP心麻痹液可能具有較好的心臟保存效果，若同時(shí)結(jié)合微

3、量灌注方法，有可能更有效的延長(zhǎng)心臟的保存時(shí)限。 目的：觀察含DZ與FDP心麻痹液對(duì)冷保存大鼠心臟能量代謝、心肌細(xì)胞凋亡、冠脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)和功能的影響，探討其心肌保護(hù)作用的機(jī)制。同時(shí)觀察微量灌注在心臟保存中的作用，探討心臟保存方法的改進(jìn)。 方法：本研究采用Langendorff離體心臟灌注模型和大鼠離體左心做功模型，分三部分進(jìn)行。第一部分，SD大鼠48只，隨機(jī)分為6組：STH組(St.ThomasⅡ號(hào)液)；D組(St.Th

4、omasⅡ號(hào)液+DZ100μmol/L)；F組(St.ThomasⅡ號(hào)液+FDP10mmol/L)；DF1組(St.ThomasⅡ號(hào)液+DZ25μmol/L+FDP2.5mmol/L)；DF2組(St.ThomasⅡ號(hào)液+DZ50μmol/L+FDP5mmol/L)；DF3組(St.ThomasⅡ號(hào)液+DZ100μmol/L+FDP10mmol/L)。在4℃條件下保存離體心臟6h，記錄保存前及保存后復(fù)灌30分鐘的心率(HR)、左心室收縮

5、壓(LVSP)、左心室舒張末壓(LVEDP)、左心室壓力變化率最大值(±dp/dtmax)、冠脈流出量(CF)等指標(biāo)的變化；并測(cè)定保存前及復(fù)灌30min時(shí)冠脈流出液中乳酸脫氫酶(LDH)及磷酸肌酸激酶(CK)的含量。第二部分：實(shí)驗(yàn)一，SD大鼠42只，隨機(jī)分為4組：對(duì)照組6只；STH組12只(St.ThomasⅡ號(hào)液)；DF組12只(St.ThomasⅡ號(hào)液+DZ50μmol/L+FDP5mmol/L)；DF+5-HD組12只(St.Th

6、omasⅡ號(hào)液+DZ50μmol/L+FDP5mmol/L+5-HD100μmol/L)。對(duì)照組直接取心肌組織，其它各組6只在4℃條件下保存心臟6h后，取左心室心肌，另外6只建立離體左心工作模型，再灌注30min后，取左心室心肌。采用高效液相法檢測(cè)心肌ATP、ADP、AMP、TNA含量并計(jì)算能荷(EC)；差速離心法提取心肌線粒體，檢測(cè)線粒體內(nèi)Ca2+含量([Ca2+]m)及線粒體呼吸功能。實(shí)驗(yàn)二，SD大鼠24只，隨機(jī)分為3組：對(duì)照組；S

7、TH組(單純St.ThomasⅡ號(hào)液)；DF組(St.ThomasⅡ號(hào)液+DZ50μmol/L+FDP5mmol/L)。對(duì)照組Langendorff灌注20分鐘后，轉(zhuǎn)為離體左心做功模型10分鐘后取心肌組織，STH組與DF組冷保存6h后，在Langendorff灌注20min，轉(zhuǎn)為離體心臟工作模型10min后取心肌組織。采用TUNEL法檢測(cè)心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)，測(cè)定心肌[Ca2+]m和丙二醛(MDA)含量；Westem-blot測(cè)定胞漿細(xì)胞色

8、素C(Cytc)含量；RT-PCR檢測(cè)心肌細(xì)胞Caspase-3mRNA含量；用熒光分光光度計(jì)檢測(cè)Caspase-3活性；電鏡下觀察線粒體結(jié)構(gòu)改變。實(shí)驗(yàn)三，SD大鼠16只，隨機(jī)分為2組：STH組(St.ThomasⅡ號(hào)液)；DF組(St.ThomasⅡ號(hào)液+DZ50μmol/L+FDP5mmol/L)。兩組在4℃條件下保存6h后，Langendorff再灌注30分鐘。測(cè)定再灌注不同時(shí)間點(diǎn)冠脈流量(CF)的變化及冠脈流出液中NO2-/NO

9、3-含量；行乙酰膽堿(Ach)誘發(fā)冠脈舒張實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)結(jié)束測(cè)心肌含水量，觀察冠脈內(nèi)皮細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)的改變。第三部分，SD大鼠36只，隨機(jī)分為6組：Ⅰ組(St.ThomasⅡ號(hào)液+DZ50μmol/L+FDP5mmol/L，滲透壓：330mosmol/L)；Ⅱ組(St.ThomasⅡ號(hào)液+DZ50μmol/L+FDP5mmol/L+甘露醇30mmol/L，滲透壓：355mosmol/L)；Ⅲ組(HTK液，滲透壓：310mosmol/L)；Ⅳ組

10、(保存液同Ⅰ組)；Ⅴ組(保存液同Ⅱ組)；Ⅵ組(保存液同Ⅲ組)。Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ組微量灌注(0.2ml/min)保存24h后，取心肌測(cè)定ATP含量、心肌含水量等指標(biāo)；Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ組微量灌注保存24h后，Langendorff灌注20分鐘，轉(zhuǎn)為離體左心做功模型10分鐘，測(cè)定心功能指標(biāo)。 結(jié)果 1.第一部分：冷保存后D組、F組、DF1組的HR、LVSP、±dp/dtmax、CF等指標(biāo)均高于STH組(P＜0.05或P＜0.01)，而LV

11、EDP、冠脈流出液中LDH和CK含量則低于STH組(P＜0.05或P＜0.01)；DF2、DF3組各項(xiàng)指標(biāo)均優(yōu)于其它組(P＜0.05或P＜0.01)；DF2與DF3組相比無(wú)明顯差別。 2.第二部分實(shí)驗(yàn)一：STH組冷保存后心肌ATP含量和EC顯著下降，分別為正常對(duì)照組的20.2％和58.7％，[Ca2+]m顯著增高，線粒體呼吸控制率(RCR)明顯降低(P＜0.01)；再灌注后心肌ATP含量及EC沒(méi)有明顯改善，[Ca2+]m進(jìn)一步增

12、高，RCR進(jìn)一步降低(P＜0.01)。DF組各項(xiàng)指標(biāo)較STH組顯著改善(P＜0.01)，冷保存后ATP及EC分別為正常對(duì)照組的44.8％和81.3％；DF+5-HD組再灌注后較DF組[Ca2+]m顯著增高，RCR顯著降低(P＜0.01)。 3.第二部分實(shí)驗(yàn)二：與對(duì)照組相比，STH組心肌細(xì)胞凋亡指數(shù)、[Ca2+]m、胞漿Cytc含量顯著增高，胞漿Caspase-3mRNA表達(dá)增加，Caspase-3活性增高(P＜0.01)。DF組

13、較STH組各項(xiàng)指標(biāo)顯著改善(P＜0.01)。 4.第二部分實(shí)驗(yàn)三：再灌注后DF組內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)損傷較STH組輕，各時(shí)間點(diǎn)CF、冠脈流出液中NO2-/NO3-含量均高于STH組(P＜0.01)，心肌含水量顯著低于STH組(P＜0.01)。Ach誘發(fā)冠脈舒張實(shí)驗(yàn)DF組冠脈流量增加的百分率均顯著高于STH組(P＜0.01)。 5.第三部分：Ⅰ組心肌含水量較Ⅱ組及Ⅲ組高(P＜0.01)，Ⅱ組與Ⅲ組之間差異不顯著(P＞0.05)；光

14、鏡下見(jiàn)Ⅰ組心肌組織間隙水腫較Ⅱ組及Ⅲ組重，電鏡下Ⅰ組、Ⅱ組及Ⅲ組線粒體結(jié)構(gòu)無(wú)明顯差別；Ⅱ組心肌組織ATP含量高于Ⅰ、Ⅲ組(P＜0.05)。再灌注后Ⅴ組、Ⅵ組的心功能指標(biāo)優(yōu)于優(yōu)于Ⅳ組(P＜0.05或P＜0.01)。Ⅴ組與Ⅵ組之間無(wú)顯著性差異(P＞0.05)。 結(jié)論 1.在St.ThomasⅡ號(hào)液中添加DZ或FDP均可改善心臟保存效果，二者伍用較單用效果更好，二者伍用比較恰當(dāng)?shù)膭┝繛椋篋Z50μmol/L+FDP5mmol/

15、L。 2.含DZ與FDP心麻痹液可減輕線粒體鈣超載、線粒體RCR降低，增加心肌ATP含量和EC，從而改善心肌能量代謝。 3.含DZ與FDP心麻痹液可通過(guò)減少自由基的產(chǎn)生、減輕線粒體鈣超載、減少線粒體Cytc的釋放、減少Caspase-3mRNA表達(dá)及Caspase-3活性等途徑抑制冷保存心臟缺血再灌注損傷引起的心肌細(xì)胞凋亡。 4.含DZ與FDP心麻痹液可減輕心臟低溫保存再灌注后冠脈內(nèi)皮細(xì)胞結(jié)構(gòu)及功能損傷。