利用RNAi技術(shù)研究CTSD和MMP1在鼻咽癌轉(zhuǎn)移中的作用.pdf

1、鼻咽癌是我國南方五省及東南亞地區(qū)高發(fā)的頭頸部惡性腫瘤之一，其發(fā)病的分子機(jī)制仍未闡明。目前，普遍認(rèn)為EB病毒感染、遺傳因素和化學(xué)致癌物是導(dǎo)致鼻咽癌發(fā)生的三大主要原因。 鼻咽癌的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致鼻咽癌治療失敗的主要原因，但目前對于鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制人們知之甚少。因此，進(jìn)一步篩選和鑒定鼻咽癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，并明確其在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過程中的作用，對于揭示鼻咽癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制有著重要意義，也對鼻咽癌的治療及預(yù)后判斷具有重要的理論和實用價值。

2、 鼻咽癌細(xì)胞5-8F和6-10B均來源于同一母細(xì)胞株SUNE-1，既往的研究已經(jīng)證實，5-8F具有高成瘤、高轉(zhuǎn)移能力，而6-10B則只成瘤、不轉(zhuǎn)移。我們實驗室利用深圳微芯公司生產(chǎn)的8046個點基因芯片比較了5-8F/6-10B之間差異表達(dá)基因，獲得一些差異表達(dá)的基因，其中CTSD和MMP1為已知的轉(zhuǎn)移相關(guān)基因，芯片的數(shù)據(jù)提示這兩個基因可能在鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮重要作用。 人CTSD基因的過度表達(dá)可促進(jìn)癌細(xì)胞的生長和轉(zhuǎn)移，是惡性

3、腫瘤預(yù)后的重要指標(biāo)之一。文獻(xiàn)報道該基因的過表達(dá)與多種惡性腫瘤，如乳腺癌、大腸癌、胃癌以及前列腺癌等的轉(zhuǎn)移相關(guān)，同時也有文獻(xiàn)報道CTSD在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮作用，但仍需進(jìn)一步的實驗證實其作用。 人MMP1基因在腫瘤演進(jìn)的多個階段均有作用，它影響腫瘤的起始、生長、血管生成、進(jìn)入血管/離開血管等過程。流式細(xì)胞分析結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染pLentiU6空白載體的5-8F細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的5-8F-E細(xì)胞的細(xì)胞周期分布沒有明顯改變；轉(zhuǎn)染pLenti

4、U6/CTSDshRNA的5-8F-EGFP細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的5-8F-EGFP細(xì)胞比較，細(xì)胞周期也沒有明顯的變化。這些數(shù)據(jù)表明抑制CTSD基因的表達(dá)對鼻咽癌細(xì)胞株5-8F-EGFP細(xì)胞周期沒有明顯的影響。 利用Boyden侵襲小室模型比較了轉(zhuǎn)染pLentiU6空白載體的5-8F-EGFP細(xì)胞與未轉(zhuǎn)染的5-8F-EGFP細(xì)胞以及轉(zhuǎn)染pLentiU6/CTSDshRNA的5-8F-EGFP細(xì)胞侵襲能力，結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染空載體pLentiU

5、6對腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力沒有明顯的影響，但是轉(zhuǎn)染干擾載體pLentiU6/CTSDshRNA后則能夠顯著性的降低細(xì)胞穿過ECMatrix膜的能力。這一結(jié)果表明，抑制CTSD基因的表達(dá)能夠降低鼻咽癌細(xì)胞株的侵襲轉(zhuǎn)移能力。 進(jìn)一步，將上述三種細(xì)胞分別原位接種到裸鼠的鼻咽部，觀察它們的轉(zhuǎn)移能力的變化。結(jié)果表明空載體對細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力基本上沒有影響，而抑制CTSD基因表達(dá)后，在一定程度上能降低接種動物的轉(zhuǎn)移能力，但這種影響并不顯著。

6、 第二部分：利用RNAi干擾技術(shù)研究MMP1基因在5-8F-EGFP細(xì)胞中的作用 這一部分主要是觀察抑制鼻咽癌細(xì)胞株5-8F-EGFP中MMP1基因的表達(dá)后對細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力的影響，實驗方法與第一部分相同。先針對靶基因MMP1構(gòu)建了2個RNAi載體：pLentiU6/MMP1shRNA1和pLentiU6/MMP1shRNA2。經(jīng)測序結(jié)果證實后，PCR證實外源DNA已整合到細(xì)胞基因組DNA中，熒光定量RT-PCR結(jié)果表明，pL

7、entiU6/MMP1shRNA1和pLentiU6/MMP1shRNA2表達(dá)載體都能特異性的引起靶基因CTSD的表達(dá)下調(diào)，其中MMP1shRNA1對目的基因的干擾效果為76％，而MMP1shRNA2對目的基因的干擾效果僅為57％。進(jìn)一步，WesternBlotting分析表明MMP1shRNA1片段的干擾效率為71.2％，而MMP1shRNA2片段的干擾效率只有59.4％。這些數(shù)據(jù)表明我們已成功地建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLentiU6/MMP1

8、shRNA的5-8F-EGFP細(xì)胞系，并且MMP1shRNA1片段的干擾效率比MMP1shRNA2片段的干擾效率要高。 流式細(xì)胞分析抑制MMP1基因表達(dá)對5-8F-EGFP細(xì)胞周期的影響，結(jié)果顯示干擾前后細(xì)胞的周期無顯著改變；用MTT法測定抑制MMP1基因表達(dá)對5-8F-EGFP細(xì)胞生長的影響，結(jié)果顯示干擾前后細(xì)胞的生長也無明顯變化；Boyden侵襲小室實驗觀察抑制MMP1基因表達(dá)對5-8F-EGFP細(xì)胞穿ECMatrix膜的能

9、力的影響，結(jié)果顯示抑制MMP1基因的表達(dá)能夠顯著性地降低細(xì)胞穿過ECMatrix膜的能力。分別原位接種干擾前后的兩種細(xì)胞到裸鼠的鼻咽部，觀察兩者轉(zhuǎn)移能力的改變，結(jié)果顯示10只接種干擾MMP1的5-8F細(xì)胞，9只原位成瘤，只有5只出現(xiàn)轉(zhuǎn)移灶，轉(zhuǎn)移率為5/9，而10接種未干擾的5-8F細(xì)胞，8只原位成瘤，8只均有轉(zhuǎn)移灶出現(xiàn)，轉(zhuǎn)移率為8/8。動物實驗表明抑制MMP1基因的表達(dá)對細(xì)胞轉(zhuǎn)移能力的沒有顯著的影響。 第三部分：用RNAi干擾技

10、術(shù)研究同時抑制CTSD和MMP1基因?qū)?-8F-EGFP細(xì)胞的作用 腫瘤的侵潤轉(zhuǎn)移是一個復(fù)雜而又連續(xù)的過程，牽涉眾多的基因共同作用和調(diào)節(jié)。為研究CTSD和MMP1對鼻咽癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移能力的影響是否同時存在作用，我們將上述實驗中構(gòu)建的針對CTSD和MMP1兩個基因的RNAi載體通過共轉(zhuǎn)染的方法導(dǎo)入到鼻咽癌細(xì)胞系5-8F-EGFP中，殺稻瘟菌素篩選獲得抗性克隆，PCR證實外源DNA已整合到細(xì)胞基因組DNA中，WesternBlotti

11、ng檢了鼻咽癌的轉(zhuǎn)移過程。 RNAi技術(shù)和可視化技術(shù)是近幾年腫瘤研究領(lǐng)域發(fā)展起來的前沿技術(shù)。RNAi是研究基因功能和進(jìn)行基因治療的全新技術(shù)，更是后基因組時代進(jìn)行基因功能高通量研究的強(qiáng)有力的工具。哈佛大學(xué)的研究者利用這一技術(shù)一次對果蠅的16000個基因進(jìn)行了發(fā)育相關(guān)功能研究，從中發(fā)現(xiàn)了300多個與發(fā)育相關(guān)的基因，如果利用傳統(tǒng)技術(shù)，這是無法想象的。另外由于RNAi具有高效、特異的靶向作用與沉默機(jī)制，使其成為治療某些傳統(tǒng)難治之癥(如惡

12、性腫瘤、AIDS等)的希望。 利用可視化技術(shù)建立的腫瘤動物模型可以幫助研究者在整體動物水平適時觀察腫瘤的生長、演進(jìn)和轉(zhuǎn)移的情況。該技術(shù)現(xiàn)已廣泛應(yīng)用于腫瘤轉(zhuǎn)移以及抗癌藥物的研究等眾多領(lǐng)域中，Hoffman領(lǐng)導(dǎo)的實驗室利用可視化技術(shù)建立了一系列的MetaMouse，為藥物篩選和腫瘤轉(zhuǎn)移研究提供了良好的動物模型。我們實驗室利用這一技術(shù)在國際上首次建成了可視化的鼻咽癌轉(zhuǎn)移模型，該模型是研究鼻咽癌轉(zhuǎn)移的極佳動物模型。 本研究是在前

13、期利用芯片篩選出在高轉(zhuǎn)移鼻咽癌細(xì)胞株5-8F中高表達(dá)的兩個轉(zhuǎn)移相關(guān)基因CTSD和MMP1的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步利用RNAi技術(shù)和可視化動物模型技術(shù)在細(xì)胞和動物整體水平上分析這兩個基因在鼻咽癌轉(zhuǎn)移過程中的作用，為闡明鼻咽癌的分子機(jī)制提供直接證據(jù)。實驗的方法和結(jié)果如下： 第一部分：利用RNAi干擾技術(shù)研究CTSD基因在5-8F-EGFP細(xì)胞的作用 采用pLentiU6慢病毒載體系統(tǒng)，構(gòu)建了針對靶基因CTSD的1個RNAi載體pLe

14、ntiU6/CTSDshRNA。經(jīng)測序結(jié)果證實后，利用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將pLentiU6/CTSDshRNA導(dǎo)入5-8F細(xì)胞，殺稻瘟菌素篩選獲得抗性克隆，PCR證實外源DNA已整合到細(xì)胞基因組DNA中，熒光定量RT-PCR結(jié)果表明，pLentiU6/CTSDshRNA表達(dá)載體能特異性的引起靶基因CTSD的表達(dá)下調(diào)，下調(diào)效果為83％。進(jìn)一步，WesternBlotting分析表明整合pLentiU6/CTSDshRNA細(xì)胞中CTSD蛋白表達(dá)

15、下調(diào)了70％，這些數(shù)據(jù)表明我們已成功地建立穩(wěn)定轉(zhuǎn)染pLentiU6/CTSDshRNA的5-8F細(xì)胞系。 為觀察抑制CTSD基因的表達(dá)對鼻咽癌的生物學(xué)特性和轉(zhuǎn)移能力的改變，測細(xì)胞克隆中CTSD和MMP1兩個基因的干擾效果，篩選出同時抑制CTSD和MMP1表達(dá)的細(xì)胞克隆。 接下來我們比較了同時抑制CTSD和MMP1基因表達(dá)的5-8F-EGFP與僅抑制MMP1基因表達(dá)以及未轉(zhuǎn)染的5-8F-EGFP三種細(xì)胞在生長能力、細(xì)胞周期

16、以及細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力的差異，發(fā)現(xiàn)同時抑制CTSD和MMP1對細(xì)胞的生長能力以及細(xì)胞的周期均沒有明顯的影響，但對細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移能力有著明顯的影響。說明MMP1與CTSD基因在介導(dǎo)鼻咽癌的轉(zhuǎn)移方面可能是同肘起作用的。 總之，我們利用RNAi技術(shù)分別和聯(lián)合干擾鼻咽癌高轉(zhuǎn)移細(xì)胞系5-8F細(xì)胞中CTSD和MMP1基因的表達(dá)，觀察了它們對細(xì)胞的生長增殖、細(xì)胞周期以及侵襲轉(zhuǎn)移能力的影響。實驗結(jié)果顯示無論是單獨還是聯(lián)合干擾CTSD和MMP1，