缺氧狀態(tài)下人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞錯配修復(fù)基因MLH1、MSH2異常甲基化的研究.pdf

1、缺氧是肺癌等實體腫瘤的主要微環(huán)境特征，其選擇壓力及其誘導(dǎo)的遺傳變異是腫窟細(xì)胞遺傳異質(zhì)性和遺傳不穩(wěn)定性的重要原因，可誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞表現(xiàn)出更具惡性的生物學(xué)表型、更強的侵襲和轉(zhuǎn)移能力以及對化療和放療的不敏感性。DNA錯配修復(fù)(MMR)在維持遺傳穩(wěn)定性中具有重要作用。已有研究表明，缺氧可能與MMR基因表達(dá)失活有關(guān)，但其機制尚不清楚。以往的研究多認(rèn)為，基因水平的改變主要為基因的突變或缺失即遺傳學(xué)層面上的改變，但隨著基因表遺傳學(xué)研究的加深，越來越多的

2、人認(rèn)識到基因的表達(dá)增高或降低與表遺傳學(xué)水平上的改變?nèi)鏒NA甲基化等相關(guān)。但是，DNA甲基化等表遺傳學(xué)水平上的改變是否參與了缺氧對MMR基因的調(diào)控尚需進(jìn)一步探討。同時，鑒于甲基化模式異常與腫瘤密切相關(guān)，而腫瘤細(xì)胞內(nèi)可能存在迫使其發(fā)生甲基化失衡的壓力，缺氧是否參與其中也值得關(guān)注。此外，甲基化作為一個可逆的調(diào)控過程，有望成為腫瘤干預(yù)新的切入點。已證實去甲基化藥物5-Aza-CdR可恢復(fù)甲基化基因的表達(dá)，并在多種腫瘤中表現(xiàn)出一定的抗癌活性，但在

3、小細(xì)胞肺癌中的應(yīng)用目前尚未見報道。 目的： 1.研究缺氧(3％O2)對人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞生物學(xué)性狀的影響。 2.觀察缺氧對錯配修復(fù)基因MLH1、MSH2表達(dá)的影響，并探討啟動子甲基化在其表達(dá)調(diào)控中的作用。 3.探討缺氧與DNA甲基化的關(guān)系。 4.研究甲基轉(zhuǎn)移酶抑制劑5-Aza-CdR對H446細(xì)胞的抑制生長作用及其與缺氧的關(guān)系。 方法： 1.觀察缺氧對H446細(xì)胞生物學(xué)性狀的

4、影響 光鏡及透射電鏡觀察缺氧條件下H446細(xì)胞的形態(tài)學(xué)變化；MTT法檢測缺氧條件下H446細(xì)胞的增殖能力及對多種化療藥物的半數(shù)抑制濃度；PI標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測缺氧條件下細(xì)胞周期分布；自發(fā)光熒光儀檢測缺氧條件下細(xì)胞內(nèi)caspase-3/7活性；羅丹明123外排實驗評估缺氧對P-gp介導(dǎo)的藥物外排能力的影響；流式細(xì)胞儀及熒光顯微鏡檢測缺氧對細(xì)胞內(nèi)活性氧簇生成的影響。 2.觀察缺氧對MLH1、MSH2基因表達(dá)的影響 R

5、T-PCR檢測MLH1、MSH2基因在mRNA水平上的表達(dá)；Westernblot檢測MLH1、MSH2基因在蛋白水平上的表達(dá)。 3.探討DNA甲基化在MLH1、MSH2基因表達(dá)下調(diào)中的作用及其與缺氧的關(guān)系 MSP檢測缺氧條件下MLH1、MSH2基因啟動子甲基化狀態(tài)的變化并測序鑒定；RT-PCR及Westernblot檢測5-Aza-CdR對缺氧條件下MLH1、MSH2基因表達(dá)的恢復(fù)作用；MS-AP-PCR檢測缺氧條件下

6、H446細(xì)胞基因組甲基化水平的變化。 4.觀察5-Aza-CdR對H446細(xì)胞的生長抑制作用及其與缺氧的關(guān)系 MTT法檢測細(xì)胞增殖能力及對多種化療藥物的半數(shù)抑制濃度；PI標(biāo)記流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞周期分布；自發(fā)光熒光儀檢測細(xì)胞內(nèi)caspase-3/7活性；羅丹明123外排實驗評估P-gp介導(dǎo)的藥物外排能力；MS-AP-PCR檢測細(xì)胞基因組甲基化水平。 結(jié)果： 1.在缺氧條件下，H446細(xì)胞增殖能力顯著減弱，胞

7、漿內(nèi)可見線粒體腫脹、細(xì)胞器空泡變、髓鞘樣改變和核糖體增多，部分細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)微腺腔；同時，H446細(xì)胞對VP-16、多柔比星等化療藥物的敏感性顯著降低，Rh123外排效率顯著增加(常氧：11.45±2.33，缺氧：17.25±1.46，P＜0.05)；隨著缺氧時間的延長，H446細(xì)胞中S期細(xì)胞顯著增加，G2期細(xì)胞顯著減少(P＜0.01)，缺氧48h后細(xì)胞內(nèi)casase-3/7活性顯著增強。H446細(xì)胞內(nèi)活性氧含量在缺氧早期顯著增多，缺氧12

8、h后顯著減少(P＜0.01)。 2.缺氧狀態(tài)下，H446細(xì)胞MLH1、MSH2基因在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均顯著性降低(P＜0.01)。同時，隨著缺氧時間延長，MSH2基因啟動子直接由非甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆谆癄顟B(tài)，所有待測CpG位點均發(fā)生甲基化，而MLH1基因啟動子逐漸由非甲基化狀態(tài)、部分甲基化狀態(tài)轉(zhuǎn)變?yōu)橥耆谆癄顟B(tài)，只有部分位點發(fā)生了甲基化。5-Aza-CdR可使缺氧狀態(tài)下H446細(xì)胞的MLH1、MSH2基因表達(dá)水平有所恢復(fù)，但

9、去除5-Aza-CdR后基因表達(dá)再次下調(diào)。常氧及缺氧條件下H446細(xì)胞基因組甲基化水平存在顯著差異，后者同時出現(xiàn)部分基因高甲基化和部分基因低甲基化。 3.常氧條件下，5-Aza-CdR可顯著降低H4416細(xì)胞的增殖能力(呈劑量依賴性，P＜0.01)，誘導(dǎo)G1期阻滯(呈時間依賴性，P＜0.05)和細(xì)胞凋亡(P＜0.05)。同時，P-gp介導(dǎo)的藥物外排效率增加，基因組DNA甲基化水平降低，但H446細(xì)胞對順鉑等化療藥物的敏感性無顯著

10、性變化。缺氧在抑制細(xì)胞增殖、誘導(dǎo)G1期阻滯和降低基因組DNA甲基化水平等方面與5-Aza-CdR具有協(xié)同作用。 結(jié)論： 1.缺氧狀態(tài)下，人小細(xì)胞肺癌H446細(xì)胞生物學(xué)性狀發(fā)生顯著改變：細(xì)胞增殖能力減弱、大量細(xì)胞阻滯在S期、凋亡潛能細(xì)胞減少、藥物外排效率增強，并對化療藥物的敏感性降低。 2.缺氧狀態(tài)下，H446細(xì)胞錯配修復(fù)基因MLH1、MSH2基因的表達(dá)顯著降低，啟動子甲基化可能是其表達(dá)下調(diào)的重要機制之一。