間充質(zhì)干細(xì)胞糾正ITP Th1優(yōu)勢(shì)性表達(dá)和誘導(dǎo)免疫耐受機(jī)制的研究.pdf

1、目的：體外觀察骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(MSCs)對(duì)特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)患者CD4+CD25+T細(xì)胞比例以及T細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10功能的影響，并探討上述兩種調(diào)控作用之間的相關(guān)性，旨在探究MSCs調(diào)節(jié)ITP免疫平衡及誘導(dǎo)自身免疫耐受的機(jī)制，從而為ITP的臨床治療奠定初步的實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。 方法：采用Ficoll分離骨髓單個(gè)核細(xì)胞，通過(guò)體外培養(yǎng)，擴(kuò)增出MSCs，并通過(guò)形態(tài)學(xué)特征及流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)其表面標(biāo)志加

2、以鑒定；通過(guò)Ficoll分離法和尼龍棉柱法獲取正常人及ITP患者外周血T淋巴細(xì)胞，并應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)T細(xì)胞中CD4+CD25+T細(xì)胞比例；MSCs經(jīng)絲裂霉素MMC處理后按不同數(shù)量(2×103、1×104、5×104個(gè)細(xì)胞/孔)接種培養(yǎng)板作為基底層細(xì)胞，然后分別接種體外分離純化的異體ITP及正常人T淋巴細(xì)胞，于2d、4d、6d后各自收集T淋巴細(xì)胞及培養(yǎng)上清，采用EI.ISA測(cè)定T細(xì)胞分泌的細(xì)胞因子IL-2、IFN-γIL-4、IL-10

3、水平；并用流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)接種于骨髓MSCs的ITP患者CD4+CD25+T細(xì)胞比例。 結(jié)果：分離培養(yǎng)的骨髓MSCs貼壁生長(zhǎng)呈梭形，原代細(xì)胞呈集落分布，10d左右達(dá)到融合，傳代細(xì)胞保持原代細(xì)胞的形態(tài)且增殖速度加快，6～7d即可達(dá)到融合；經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測(cè)骨髓MSCs高表達(dá)CD29、CD105、CD166，低表達(dá)CD34、CD45、HLA-DR，3代以后的細(xì)胞中MSCs純度達(dá)到95％以上；尼龍棉柱法分離的T淋巴細(xì)胞純度可達(dá)到70％～8

4、0％左右。流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果，ITP患者外周血CD4+CD25+T細(xì)胞數(shù)量及CD4+CD25+7CD4+比值均明顯低于正常對(duì)照組(P<0.05)；在PHA作用下，數(shù)量>1x104的骨髓MSCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)4d后，與正常對(duì)照組相比，MSCs可顯著上調(diào)ITP患者及正常人T淋巴細(xì)胞中CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞比例及CD4+CD25+/CD4+比值(P<0.05)，且隨MSCs量的增加，作用增強(qiáng)(P<0.05)。本研究未檢測(cè)到骨髓MSC

5、s本身分泌IL-2、IFN-γ、IL-4及IL-10。在PHA作用下，ITP患者T淋巴細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IL-2、IFN-γ較正常人高(P<0.05)，IL-4、IL-10較正常人低(P<0.05)。骨髓MSCs與T淋巴細(xì)胞共培養(yǎng)后，與對(duì)照組相比，MSCs可顯著抑制ITP患者或正常人T淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ(P<0.05)，且隨MSCs數(shù)量增加，抑制作用增強(qiáng)(P<0.05)，共培養(yǎng)4d、6d其抑制作用明顯強(qiáng)于2d(P<0.05)

6、；MSCs可促進(jìn)ITP患者T淋巴細(xì)胞分泌IL-4、IL-10(P<0.05)，且隨MSCs數(shù)量增加，促進(jìn)作用增強(qiáng)(P<0.05)；MSCs對(duì)IL-4的作用與培養(yǎng)時(shí)間無(wú)顯著相關(guān)性(P>0.05)，但對(duì)IL-10促進(jìn)作用隨時(shí)間延長(zhǎng)而增強(qiáng)(P<0.05)；當(dāng)MSCs數(shù)量>1×104可促進(jìn)正常人T淋巴細(xì)胞分泌IL-4(P<0.05)，且隨MSCs數(shù)量增加，促進(jìn)作用增強(qiáng)(P<0.05)，共培養(yǎng)4d、6d作用明顯強(qiáng)于2d(P<0.05)；MSCs可

7、促進(jìn)正常人T淋巴細(xì)胞分泌IL-10(P<0.05)，且隨MSCs數(shù)量增加，促進(jìn)作用增強(qiáng)(P<0.05)，共培養(yǎng)4d、6d其促進(jìn)作用明顯強(qiáng)于2d(P<0.05)。體外骨髓MSCs對(duì)ITP患者T淋巴細(xì)胞分泌IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10具有調(diào)控作用，同時(shí)對(duì)CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞具有上調(diào)作用，以上這種機(jī)制可使ITP患者的細(xì)胞因子及CD4+CD25+T淋巴細(xì)胞逐漸接近于正常人但仍達(dá)不到正常人水平(P<0.05)。 結(jié)論