HER2靶向性重組tBid分子對骨肉瘤SOSP-9607細胞的促凋亡作用.pdf

1、骨肉瘤(osteosarcoma) 是兒童和青少年最常見的骨原發(fā)性惡性腫瘤。20世紀70年代以前，主要治療方法是截肢和關(guān)節(jié)離斷，從外科治療到出現(xiàn)肺轉(zhuǎn)移的平均時間為8個月，5年生存率<25％。隨著外科技術(shù)和影像學(xué)的發(fā)展，新輔助化療和免疫治療的進步，骨肉瘤治愈率有了明顯改進，5年生存率達到80％。但目前的治療手段仍無法解決腫瘤病人的轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)和藥物耐藥等情況，腫瘤的基因靶向性分子治療的出現(xiàn)為骨肉瘤的治療開辟了一條新的治療途徑。 Bi

2、d（BH3-interacting domain death agonist）是一種僅含有BH3結(jié)構(gòu)域的Bcl-2家族成員蛋白，全長為195aa，分子量為22kDa。Bid位于細胞漿內(nèi)，在死亡受體介導(dǎo)的細胞凋亡信號途徑中, 可引起Caspase-8聚集活化,活化的Caspase-8切割Bid，去除N末端片段，形成活性的截短的Bid ( truncated Bid，tBid)分子。tBid的分子量為15kDa，從細胞漿轉(zhuǎn)位到線粒體中，通過

3、調(diào)節(jié)細胞色素c（Cyt c）釋放和其他線粒體凋亡分子調(diào)節(jié)凋亡過程。 HER2/neu分子是癌基因erbB2的編碼產(chǎn)物，其編碼基因定位于人染色體17q21，是具有酪氨酸蛋白激酶活性的跨膜蛋白，是表皮生長因子（EGF）受體家族的成員之一。通常情況下，HER2/neu只在胎兒時期表達，到成年以后，僅有低水平表達于細胞表面。HER2/neu的過度表達存在于多種腫瘤組織，如轉(zhuǎn)移性乳腺癌（25％-30％）、炎癥性乳腺癌（50％）、轉(zhuǎn)移性導(dǎo)管

4、癌（60-70％）、非小細胞肺癌（13-55％）、卵巢癌（18-43％）、子宮內(nèi)膜癌（10-52％）、直腸結(jié)腸癌（33-85％）、腎癌（22-36％）、頭頸癌（16-50％）、胃癌（21-64％）、食道癌（10-26％）、前列腺癌（5-46％）等。另40-44％成骨肉瘤及58％成骨肉瘤肺轉(zhuǎn)移等，成為一種公認的腫瘤標志物。 本研究將信號肽、單鏈抗體、來源于綠膿桿菌的具有膜轉(zhuǎn)位作用的肽段和tBid融合，構(gòu)建分泌型靶向促凋亡分子Imm

5、uno-tBid（pCMV-e23sFv-PEⅡ(253-364)-tBid61，即pCMV-5-2），使其能特異性識別、內(nèi)化并轉(zhuǎn)位進入細胞液中，誘導(dǎo)HER2陽性的腫瘤細胞凋亡。 首先采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將tBid基因轉(zhuǎn)染骨肉瘤細胞系SOSP-9607，通過間接免疫熒光法、流式細胞儀及電鏡等方法，對tBid的促調(diào)亡活性進行了檢測。實驗結(jié)果顯示tBid在骨肉瘤細胞中能夠有效得到表達，轉(zhuǎn)染pcDNA3空載體的對照組細胞形態(tài)正常，細胞膜完

6、整，而轉(zhuǎn)染pcDAN3-tBid61的實驗組細胞則變得較少，形態(tài)發(fā)生改變，體積變小并且固縮。對轉(zhuǎn)染細胞進行電鏡觀察，發(fā)現(xiàn)細胞膜出胞，胞核濃縮，染色質(zhì)聚集等凋亡特征。使用流式細胞儀、Annexin V和PI雙染，監(jiān)測細胞膜表面磷脂酰絲氨酸外翻情況，結(jié)果表明，與對照組細胞（6％）相比，實驗組早期調(diào)亡和凋亡繼發(fā)死亡率為35.8％。 進一步采用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將重組的活性tBid 融合蛋白基因（pCMV-5-2）轉(zhuǎn)染HER2陽性骨肉瘤SOS

7、P-9607細胞，觀察其對骨肉瘤SOSP-9607細胞的凋亡誘導(dǎo)作用。通過間接免疫熒光的方法從細胞形態(tài)學(xué)的變化來檢測凋亡，觀察到轉(zhuǎn)染目的基因后有細胞固縮、核濃縮等凋亡特征。進一步通過Annexin V染色、流式細胞儀檢測，與對照組細胞（6％）相比，凋亡率為42％，表明細胞膜表面有磷脂酰絲氨酸外翻，說明重組Immuno-tBid基因表達后有促凋亡作用。 將pCMV-5-2基因用脂質(zhì)體包裹，肌肉注射荷有HER2陽性骨肉瘤（SOSP-

8、9607）的裸鼠，可觀察到治療組瘤體生長速度慢于對照組。免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，Immuno-tBid蛋白選擇性地分布于治療組裸鼠的腫瘤組織和肌肉組織中，其他組織如心、肝、脾、肺、腎臟中，以及在對照組腫瘤組織中，染色呈陰性或弱陽性，后者可能是內(nèi)源性Bid表達的結(jié)果。進一步對腫瘤組織進行TUNEL染色，可檢測到治療組的腫瘤細胞呈現(xiàn)TUNEL陽性。以上結(jié)果表明Immuno-tBid選擇性地分布于HER2陽性的腫瘤組織中，并通過引起腫瘤細胞凋亡