臨床常見革蘭陰性菌Ⅰ類整合子結(jié)構(gòu)與功能的研究.pdf

1、目的： 1.調(diào)查隨機(jī)選取的溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院分離的179株肺炎克雷伯菌和107產(chǎn)株超廣譜β-內(nèi)酰胺酶革蘭陰性菌對(duì)臨床常見抗菌藥物的敏感性； 2.分析溫州醫(yī)學(xué)院附屬第一醫(yī)院分離的臨床常見革蘭陰性菌中Ⅰ類整合子分布； 3.探討Ⅰ類整合子介導(dǎo)的耐藥性機(jī)制和耐藥基因播散的分子機(jī)制，為臨床合理使用抗菌藥物提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)； 4.分析Ⅰ類整合子可變區(qū)結(jié)構(gòu)與功能及常見基因盒的分子進(jìn)化關(guān)系； 5.分析本實(shí)驗(yàn)室完成

2、的一株肺炎克雷伯菌(F03株)質(zhì)粒全序列中Ⅰ類整合子的結(jié)構(gòu)構(gòu)與功能。 方法： 1.按《全國(guó)臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》分離細(xì)菌，采用法國(guó)生物梅里埃公司VITEK60細(xì)菌鑒定儀鑒定細(xì)菌；利用E試驗(yàn)(E-test，濃度梯度瓊脂擴(kuò)散試驗(yàn))進(jìn)行藥物MIC測(cè)定； 2.參照Ⅰ類整合子序列(AM939644)，利用Primer3軟件在序列保守區(qū)設(shè)計(jì)Ⅰ類整合子特異性引物擴(kuò)增Ⅰ類整合子可變區(qū)； 3.PCR擴(kuò)增、DNA自動(dòng)測(cè)序及Phr

3、ed/Phrap/Consed軟件包拼接，用美國(guó)TIGR研究所提供的Glimmer3軟件預(yù)測(cè)ORF，以分析Ⅰ類整合子可變區(qū)基因盒結(jié)構(gòu)； 4.利用ClustalX和mega3軟件分析Ⅰ類整合子基因盒耐藥基因的分子進(jìn)化關(guān)系； 5.用Glimmer3及相關(guān)生物信息學(xué)軟件預(yù)測(cè)本實(shí)驗(yàn)室完成的一株肺炎克雷伯菌質(zhì)粒(pKF3-147)全序列上Ⅰ類整合子，詳細(xì)分析該質(zhì)粒攜帶的Ⅰ類整合子結(jié)構(gòu)與功能。 結(jié)果： 1.藥敏試驗(yàn)結(jié)

4、果：1)肺炎克雷伯菌對(duì)氨芐西林的耐藥率最高，對(duì)丁胺卡那和泰能的耐藥率最低。上述細(xì)菌絕大部分為多重耐藥菌株；2)不同年代肺炎克雷伯桿菌的耐藥率的比較發(fā)現(xiàn)：從2004年到2006年，對(duì)哌拉西林、頭孢他啶、慶大霉素、復(fù)方新諾明耐藥率逐年升高，而從2006年到2007年卻呈現(xiàn)下降趨勢(shì)；3)在四種不同ESBL陽(yáng)性菌中鮑曼不動(dòng)桿菌多重耐藥情況最嚴(yán)重。 2.各種革蘭陰性菌中均有Ⅰ類整合子的檢出，檢出的整合子大小、結(jié)構(gòu)存在多種類型；肺炎克雷伯菌

5、的Ⅰ類整合子在不同年代的檢出率不同，從2002年至2005年間呈上升趨勢(shì)，2005年至2007年呈下降趨勢(shì)；不同ESBL陽(yáng)性的四種革蘭陰性菌中，鮑曼不動(dòng)桿菌中Ⅰ類整合子的檢出率最高。 3.本研究發(fā)現(xiàn)的基因盒主要有6種不同類型，分別介導(dǎo)細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類、鏈霉素、氯霉素及磺胺類藥物的耐藥，未發(fā)現(xiàn)常見的耐β-內(nèi)酰胺類藥基因盒。其中以鏈霉素腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基和二氫葉酸還原酶基因(ctg14a、14b、18、20)出現(xiàn)頻率最高，占33.0％(

6、32/97)。整合子可變區(qū)存在上述單個(gè)基因，也有存在多個(gè)基因之間的組合，本研究發(fā)現(xiàn)有5種不同的組合方式，其中以dfr、sad組合(ctg14a、14b、18、20、21)最為常見占56.7％(55/97)，aac(6’)、cat(4’)、.sad(3”)組合(ctgllb)次之，占19.6％(19/97)。同一耐藥基因盒及同一基因組合可以出現(xiàn)在不同的革蘭陰性菌中，同一菌株中可以存在多種耐藥基因盒和多種不同的基因組合方式。 4.對(duì)

7、二氫葉酸還原酶基因系統(tǒng)發(fā)生分析，可以發(fā)現(xiàn)Ⅰ類整合子所攜帶的二氫葉酸還原酶基因可分成4個(gè)組，分別與二氫葉酸還原酶基因第15型、5型、7型和13型基因較接近。 5.對(duì)多重耐藥且ESBL陽(yáng)性的肺炎克雷伯菌中F03株上3個(gè)大質(zhì)粒進(jìn)行質(zhì)粒DNA全序列的生物信息學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)其中大質(zhì)粒(pKF3-147)上存在攜帶二氫葉酸還原酶基因和鏈霉素腺苷酰轉(zhuǎn)移酶基因的Ⅰ類整合子，與該菌中檢測(cè)出的Ⅰ類整合子PCR產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果一致。 結(jié)論：

8、 1.肺炎克雷伯菌對(duì)氨芐西林的耐藥率最高，對(duì)丁胺卡那和泰能的耐藥率最低。本研究中絕大部分為多重耐藥菌株，ESBL陽(yáng)性菌中多重耐藥現(xiàn)象嚴(yán)重，且鮑曼不動(dòng)桿菌檢出率最高。 2.Ⅰ類整合子廣泛存在于該院臨床常見革蘭陰性菌中。02到07年間，05年Ⅰ類整合子的檢出率最高。在四種ESBL陽(yáng)性菌株中，鮑曼不動(dòng)桿菌Ⅰ類整合子的檢出率最高。 3.Ⅰ類整合子可變區(qū)主要攜帶氨基糖苷類、氯霉素、磺胺類藥物的抗性基因，以氨基糖苷類耐藥基因最多見，