粗糙脈胞菌中兩個纖維二糖脫氫酶基因的同源表達(dá)、蛋白純化及作用機(jī)制研究.pdf

1、世界能源資源和環(huán)境問題日趨嚴(yán)重。經(jīng)過長期的研究，人類希望通過纖維素酶的應(yīng)用將地球上最豐富、最廉價的植物纖維轉(zhuǎn)化為能被人類使用的能源和資源。目前纖維素酶已被廣泛應(yīng)用于食品，釀酒，紡織，農(nóng)業(yè)等各個領(lǐng)域，隨著纖維素酶需求量的增加，高效纖維素降解菌和纖維素酶的獲得已成為世界各國微生物界研究的熱點(diǎn)。粗糙脈胞菌(Neurospora crassa，N.crassa)是子囊菌中的模式菌株，它也是高效的纖維素降解菌，能產(chǎn)生一系列木質(zhì)纖維素降解酶，包括纖

2、維二糖脫氫酶(cellobiosedehydrogenase，CDH)。CDH是一個血紅素黃素蛋白酶，屬于葡萄糖-甲醇-膽堿(GMC)氧化還原酶家族。本實驗以N.crassa為研究對象，對其CDH的產(chǎn)量及特性開展研究。N.crassa基因組中有兩個假定的纖維二糖脫氫酶基因（cdh），cdh只有在纖維素降解條件下才能被誘導(dǎo)表達(dá)。敲除基因nc-cdh1，菌株的CDH酶活基本消除;而敲除基因nc-cdh2對CDH總酶活影響很小，由此推測酶NC

3、-CDH1在CDH總酶活性中占主要地位。
　　通過組成型強(qiáng)啟動子3-磷酸甘油醛脫氫酶基因(gpdA)，我們將基因nc-cdh1和nc-cdh2進(jìn)行同源表達(dá)，使過表達(dá)菌株在非纖維素誘導(dǎo)條件下也能表達(dá)并分泌重組CDH。改進(jìn)蛋白純化方法，將NC-CDH1和NC-CDH2成功純化，此后進(jìn)行了一系列酶學(xué)性質(zhì)研究。研究表明:NC-CDH1和NC-CDH2有一個相近的最適反應(yīng)pH值6.0，最適反應(yīng)溫度都在45-55℃之間;這兩個酶在pH值4.0

4、-7.0的緩沖液中都能穩(wěn)定保存，當(dāng)環(huán)境溫度為20-30℃時兩個酶在10小時內(nèi)都能較好地保持活性。SDS-PAGE結(jié)果表明NC-CDH1分子量約為100 kDa，而NC-CDH2分子量約為130 kDa，用N-糖苷酶F(N-glycosidase F)進(jìn)行去N端糖基化處理后兩個CDH蛋白具有相近的分子量95 kDa。
　　NC-CDH2不含纖維素結(jié)合域(CBD)，與微晶纖維素和濾紙的結(jié)合能力遠(yuǎn)遠(yuǎn)低于NC-CDH1，在野生型菌株N.c

5、rassa的CDH總酶活中所占比重很低。但NC-CDH2與NC-CDH1相比有相近的比活力(7.93 vs.8.89IU mg-1)，甚至NC-CDH2還有更小的Km值(5.79 vs.25.72 mM)。綜上所述，我們推斷野生型菌株N.crassa的NC-CDH2酶活低是由基因的低表達(dá)量導(dǎo)致的。
　　突變株△cdh-1的粗酶水解微晶纖維素的能力明顯下降，回補(bǔ)NC-CDH1能使突變株纖維素酶活恢復(fù)到野生型菌株水平，而NC-CDH1