葡萄糖脫氫酶基因表達(dá)及吡咯喹啉醌生物合成.pdf

1、葡萄糖脫氫酶(Glucose dehydrogenase，GDH)包括NADP+依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶和醌蛋白葡萄糖脫氫酶。作為磷酸戊糖途徑的關(guān)鍵酶，NADP+依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶在食品醫(yī)藥領(lǐng)域發(fā)揮重要作用。醌蛋白葡萄糖脫氫酶以吡咯喹啉醌(Pyrroloquinoline quinone，PQQ)為輔酶，作為新型輔因子在醫(yī)藥等方面而引起關(guān)注。葡萄糖脫氫酶的生物學(xué)功能研究雖有一段歷史，但需完善，同時(shí)吡咯喹啉喹的產(chǎn)量還處于很低水平，本課題針對(duì)目前

2、存在的問(wèn)題做了深入研究，旨在研究葡萄糖脫氫酶的生物學(xué)功能及提高吡咯喹啉醌的發(fā)酵產(chǎn)量:
　　1、對(duì)來(lái)源于肺炎克雷伯氏菌和大腸桿菌中的NADP+依賴(lài)的葡萄糖脫氫酶的基因序列進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建工程菌，通過(guò)測(cè)定三株工程菌生物量、葡萄糖剩余量以及酶活，發(fā)現(xiàn)相比帶有空質(zhì)粒的菌株，三株工程菌的生物量顯著提高，葡萄糖剩余量明顯減少，酶活性分別提高為8.5倍、10.5倍和12倍，表明葡萄糖脫氫酶的超表達(dá)可以促進(jìn)菌體生長(zhǎng)。
　　2、PCR擴(kuò)增來(lái)源于

3、大腸桿菌中的醌蛋白葡萄糖脫氫酶基因，構(gòu)建重組載體后導(dǎo)入到肺炎克雷伯氏菌中。隨后通過(guò)高效液相色譜法探索PQQ檢測(cè)條件，確定波長(zhǎng)為200 nm，流速為0.8 mL/min，并確定流動(dòng)相中甲醇與水（加入5‰磷酸）的泵比例為10∶90，繪制PQQ標(biāo)準(zhǔn)曲線，R2為0.999，并對(duì)構(gòu)建的工程菌中PQQ含量進(jìn)行檢測(cè)。
　　3、以PQQ的合成前體物谷氨酸和酪氨酸為切入點(diǎn)，分別進(jìn)行單因素水平和四因素三水平正交實(shí)驗(yàn)做發(fā)酵條件優(yōu)化。單因素實(shí)驗(yàn)中分別添加