胰腺癌相關(guān)免疫原性膜抗原的蛋白質(zhì)組學(xué)篩查.pdf

1、研究背景：胰腺癌惡性度高，進展迅速，生物學(xué)行為特異；目前臨床早期診斷困難，治療方法有限。胰腺癌相關(guān)膜抗原在實現(xiàn)其獨特的生物學(xué)行為、參與免疫活動中有重要作用；如能篩查尋找到特異性較好的胰腺癌相關(guān)膜抗原，則后者可能用于臨床胰腺癌的血清標(biāo)志物診斷、分子影像診斷、免疫靶向治療。研究顯示胰腺癌患者血清內(nèi)存在針對腫瘤抗原的自身抗體，這些抗體可作為線索來篩查胰腺癌相關(guān)膜抗原。 研究目的：本實驗擬篩查胰腺癌相關(guān)免疫原性膜抗原，并對篩查出的候選膜

2、抗原進行驗證。 研究方法：以MTT生長曲線、平板克隆生成實驗、劃痕愈合實驗、異質(zhì)粘附實驗、Boyden小室跨膜侵襲遷移實驗等考查Capan-1、MiaPaCa-2、Panc-1三株胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能，綜合評價其代表性。提取上述三株細(xì)胞的膜蛋白，將混合膜蛋白通過一維等電聚焦(IEF)及二維電泳(2-DE)分離，平行2-DE膠分別行考馬斯亮藍(lán)染色與免疫印跡雜交(WesternBlot)。留取臨床上37例胰腺癌、12例慢性胰腺炎患

3、者血清純化IgG，分別作為免疫印跡雜交一抗使用。雜交陽性蛋白位點使用基質(zhì)輔助激光解吸離子化飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)分析與肽質(zhì)指紋庫(PMF)鑒定。使用NCBI、UniProtKB/Swiss-Prot、ExPASy等網(wǎng)絡(luò)平臺，對陽性點基因序列、蛋白序列、蛋白結(jié)構(gòu)域、疏水性、同源性、相互作用、蛋白功能等生物學(xué)信息進行分析，尋找其作為胰腺癌相關(guān)膜抗原的生物信息學(xué)依據(jù)。通過細(xì)胞株RT-PCR、realtimePCR、Weste

4、rnblot、組織芯片免疫組化染色等方法，分別在細(xì)胞株、組織層面，從基因與蛋白質(zhì)兩個水平對篩查出的膜抗原進行有效性驗證。 結(jié)果： 1.Capan-1、MiaCaPa-2、Panc-1三株胰腺癌細(xì)胞的生物學(xué)功能具有較顯著的差異：Capan-1與MiaPaCa-2的增殖能力較強而Panc-1稍弱；Panc-1的侵襲遷移能力最強，Capan-1與MiaPaCa-2稍弱弱。 2.胰腺癌細(xì)胞混合膜蛋白與胰腺癌患者血清IgG

5、免疫印跡雜交共出現(xiàn)8個陽性點，與慢性胰腺炎IgG雜交所出現(xiàn)的2個陽性點無重復(fù)；質(zhì)譜分析鑒定出5個候選膜抗原：VDAC-1、VDAC-2、CHCHD3、SLP-2、TOM40。 3.VDAC-1、2、TOM40為線粒體外膜蛋白，與線粒體物質(zhì)運輸、受體-配體識別、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)等多方面功能有關(guān)；SLP-2為與細(xì)胞骨架相關(guān)聯(lián)的癌癥相關(guān)蛋白，可能與腫瘤發(fā)生相關(guān)。 4.RT-PCR與實時PCR提示：VDAC-1、VDAC-2、CHCHD

6、3、SLP-2、TOM40等五個分子的基因在Capan-1、MiaCaPa-2、P3、Panc-1、SW1990五株胰腺癌細(xì)胞中均有表達(dá)；WesternBlot提示：SLP-2在五株胰腺癌細(xì)胞株中均有表達(dá)，在胰腺癌組織呈顯著高表達(dá)。 結(jié)論： 1.Capan-1、MiaCaPa-2、Panc-1三株胰腺癌細(xì)胞在生物學(xué)功能上差異顯著，具有一定代表性。 2.VDAC-1、VDAC-2、CHCHD3、SLP-2、TOM4