重組腺病毒介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因?qū)Υ竽X皮層神經(jīng)元缺氧保護(hù)作用的研究.pdf

1、第一部分重組腺病毒介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因抗大腦皮層神經(jīng)元缺氧的研究
　　目的：探討重組腺病毒介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因?qū)Υ笫蟠竽X皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧后的保護(hù)作用，為臨床治療缺血缺氧性腦血管病提供更多的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。
　　方法：制備大鼠大腦皮層神經(jīng)元體外原代培養(yǎng)及缺氧的模型；倒置顯微鏡下觀察正常和缺氧神經(jīng)元的生長情況；免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定大鼠大腦皮層神經(jīng)元；將帶有綠色熒光蛋白（Green fluorescence protein，G

2、FP）的重組腺病毒介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因（Recombinant adenovirus-mediated hypoxia inducible factor-1 alpha gene，AdHIF-1α）及重組腺病毒空載體（Recombinant adenovirus empty vector，Ad）轉(zhuǎn)染缺氧的神經(jīng)元，并分5個(gè)時(shí)間點(diǎn)（12h，24h，48h，72h及96h）在熒光顯微鏡下觀察 AdHIF-1α及 Ad的轉(zhuǎn)染效率；將實(shí)驗(yàn)

3、神經(jīng)元分為正常對(duì)照（Normoxia）組、缺氧（Hypoxia）組、 AdHIF-1α轉(zhuǎn)染組及 Ad轉(zhuǎn)染組，透射電鏡下觀察各實(shí)驗(yàn)組神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)的變化。
　　結(jié)果：（1）神經(jīng)元的原代培養(yǎng)：初種神經(jīng)元2h開始貼壁，48h后可見大部分細(xì)胞貼壁，細(xì)胞形態(tài)比較單一，呈圓球形，偶見細(xì)胞長出突起。第5天神經(jīng)元中混雜有較多的膠質(zhì)細(xì)胞，換 N2培養(yǎng)液抑制雜質(zhì)細(xì)胞的生長，培養(yǎng)至第11天，神經(jīng)元生長旺盛，純化率達(dá)95％以上。（2）免疫細(xì)胞化學(xué)鑒定：取

4、培養(yǎng)至第11天的神經(jīng)元，加入小鼠神經(jīng)絲（Neurofilament，NF）抗體，二氨基聯(lián)苯胺（Diaminobenzidine，DAB）染色，光鏡下NF陽性神經(jīng)元的細(xì)胞質(zhì)和突起呈棕色或棕褐色，細(xì)胞核深染，形態(tài)呈圓形、圓錐形，從胞體伸出突起，并與周圍細(xì)胞連接，突起多為單極或雙極，證實(shí)所培養(yǎng)的細(xì)胞為皮層神經(jīng)元。（3）缺氧模型的建立：將用于實(shí)驗(yàn)的神經(jīng)元換用含100μmol/LCoCl2及2%胎牛血清（Fetal bovine serum，F(xiàn)B

5、S）的DMEM培養(yǎng)液分別繼續(xù)培養(yǎng)12h，24h，48h及72h，經(jīng)過形態(tài)學(xué)觀察和缺氧模型預(yù)實(shí)驗(yàn)，證實(shí)缺氧24h適合用作缺氧模型。（4）熒光顯微鏡下觀察AdHIF-1α及Ad的轉(zhuǎn)染效率：AdHIF-1α及Ad轉(zhuǎn)染缺氧的神經(jīng)元后，12h可見有少許熒光開始表達(dá)，24h熒光表達(dá)稍增加，48h熒光表達(dá)最明顯，72h熒光表達(dá)下降，96h熒光表達(dá)微弱。（5）神經(jīng)元超微結(jié)構(gòu)變化的觀察：透射電鏡下Normoxia組神經(jīng)元形態(tài)及染色質(zhì)正常、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、線粒體等

6、結(jié)構(gòu)正常；Hypoxia組及 Ad組細(xì)胞水腫，細(xì)胞器破壞或消失；AdHIF-1α組細(xì)胞核形態(tài)結(jié)構(gòu)及染色質(zhì)分布未見明顯異常，細(xì)胞器以線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)為主，個(gè)別略顯水腫。證實(shí)AdHIF-1α可改善缺氧對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞器的損傷，維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的完整性。
　　結(jié)論：（1）本實(shí)驗(yàn)研究所建立的大鼠大腦皮層神經(jīng)元原代培養(yǎng)模型及缺氧模型是成功的，可用于腦缺血缺氧性疾病的體外實(shí)驗(yàn)的研究；（2）AdHIF-1α可顯著改善缺氧后損傷神經(jīng)元的超微結(jié)構(gòu)，對(duì)缺氧后的

7、神經(jīng)元具有保護(hù)作用。
　　第二部分Western blot法定量檢測(cè)AdHIF-1α及Ad轉(zhuǎn)染缺氧神經(jīng)元后各組神經(jīng)元中HIF-1α、EPO及VEGF蛋白的表達(dá)
　　目的：探討重組腺病毒介導(dǎo)的缺氧誘導(dǎo)因子-1α基因?qū)Υ竽X皮質(zhì)神經(jīng)元缺氧的保護(hù)作用機(jī)制，為臨床治療缺血缺氧性腦血管病提供新的治療思路。
　　方法：蛋白質(zhì)印跡（Western blot）法觀察正常對(duì)照（Normoxia）組、缺氧(Hypoxia)組、重組腺病毒介導(dǎo)

8、的HIF-1α基因(Recombinant adenovirus-mediated hypoxia-inducible factor-1 alpha gene，AdHIF-1α）轉(zhuǎn)染組及重組腺病毒空載體(Recombinant adenovirus empty vector，Ad)轉(zhuǎn)染組神經(jīng)元中缺氧誘導(dǎo)因子-1α（Hypoxia-inducible factor-1 alpha，HIF-1α）、促紅細(xì)胞生成素（Erythropoieti

9、n，EPO）及血管內(nèi)皮生長因子（Vascular endothelial growth factor，VEGF）蛋白的定量表達(dá)變化。
　　結(jié)果：AdHIF-1α轉(zhuǎn)染組HIF-1α、EPO、VEGF蛋白12h開始表達(dá)，24h表達(dá)增加，48h達(dá)高峰，72h下降，與缺氧組相比有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.01，P<0.05)，Ad組與缺氧組相比無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)論：（1）正常的神經(jīng)元中含有少量的HIF-1α基因，缺氧后HIF-1α基因