O139群霍亂弧菌基因工程減毒活疫苗候選株構建及初步評價.pdf

1、研究背景與目的: 霍亂是一種由霍亂弧菌引起的烈性傳染病，致劇烈腹瀉并能快速傳播。世界第七次大流行自1961年延續(xù)至今，波及世界五大洲100多個國家，尚未得到有效控制。根據(jù)O抗原，霍亂弧菌分為200多個血清群，能引起霍亂的有O1群的古典型霍亂弧菌、El Tor型霍亂弧菌及O139群霍亂弧菌。霍亂第六次大流行延續(xù)到1961年，是由古典型霍亂弧菌引起的，而第七次大流行是由El Tor型霍亂弧菌引起的。O139血清型霍亂弧菌，是自199

2、2年從印度半島開始流行的一種新型霍亂，且O139群與O1群疫苗的交叉保護力低。有證據(jù)表明O139群霍亂弧菌起源于El Tor型霍亂弧菌，從非O1群霍亂弧菌中獲得O139表型，因此O139群霍亂弧菌獲得了O1群的毒力和非O1群霍亂弧菌的莢膜。 霍亂弧菌主要致病因子是霍亂毒素（CT），由CTX元件中的ctxAB基因編碼，受環(huán)境信號影響和調(diào)節(jié)。CTX遺傳元件來自CTXФ噬菌體，很有可能可以在環(huán)境中的霍亂弧菌間傳遞。CTXФ是一個約6．

3、9kb大小的單股絲狀噬菌體，有兩個部分組成：2．4kb的RS2序列和4．5kb的核心區(qū)。RS2是調(diào)節(jié)序列，從5’端到3’端為rstR，rstA和rstB，其中rstR編碼一抑制蛋白rstR，介導了CTXФ的噬菌體免疫。而核心區(qū)有六個基因，包括ctxAB操縱子?；魜y毒素由5個受體結合B亞單位圍繞1個毒性A亞單位組成，作用于小腸，與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1結合后通過增強腺苷酸環(huán)化酶活性而提高腸道內(nèi)環(huán)磷酸腺苷（cAMP）水平，并將氯化物和碳酸氫鹽分泌

4、到小腸，導致水分從機體血管內(nèi)和細胞外間隙排出，迅速進入腸腔，從而造成嚴重腹瀉。 基因敲除技術從20世紀80年代末開始發(fā)展，在生命科學領域有廣泛應用前景。同源重組是基因敲除的方法之一，而自殺質(zhì)粒是一種通過同源重組技術來構建無痕缺失突變株的有效載體，其利用目標基因兩端的同源片段，精確定位自殺質(zhì)粒的整合位點。采用“上游片斷-插入基因-下游片斷”方式缺失的菌株能夠避免極性效應，并使靶基因完全失活。 隨著對腸道黏膜免疫重要性的認識

5、以及霍亂弧菌分子生物學研究的深入和基因重組技術的發(fā)展，霍亂疫苗的研究逐步傾向于通過基因工程方法缺失霍亂毒素及其他毒力相關基因的減毒活疫苗研制，如O1群減毒活疫苗的CVD103-HgR，Peru-15和V． cholerae638以及O139群霍亂弧菌減毒活疫苗的Bengal-15和CVD112等。這些疫苗能激發(fā)機體產(chǎn)生類似天然霍亂感染后的免疫反應，但也存在一些副反應，及可能通過噬菌體感染獲得毒力基因如CTXФ而使毒力回復。 本研

6、究以O139群霍亂弧菌ZJ199693為出發(fā)株，通過基因重組技術缺失其染色體上的主要毒力基因簇TLC、CTX和RTX，并插入rstR和ctxB基因，再進一步缺失溶血素編碼基因hlyA，同時插入篩選標記綠色熒光蛋白編碼基因GFPuv，構建O139群霍亂弧菌減毒活疫苗候選株。我們的目的是缺失O139群霍亂弧菌的主要毒力基因并盡量減少疫苗候選株的副反應及毒力回復可能，并通過綠色熒光蛋白的整合使疫苗候選株與野生菌株在環(huán)境中易于區(qū)分。 其

7、中，TLC因子功能與CTXФ獲得與復制有關，CTX基因簇主要攜帶了編碼霍亂毒素CT的ctxAB基因和CTXФ整合的attB位點，而RTX毒素與Hep-2細胞毒性有關，使哺乳動物細胞肌動蛋白交聯(lián)而致細胞圓縮?；魜y弧菌的溶血素（HlyA）是一個分子量為65000的水溶性孔形成毒素，由hlyA編碼。RTX毒素及溶血素均能引起小鼠腸道感染，都是引起霍亂弧菌減毒活疫苗反應原性的主要因子。把TLC、CTX、RTX基因簇及hlyA基因缺失后我們能大大

8、降低霍亂弧菌毒性及毒力回復的可能性。并且，由于rstR基因編碼的產(chǎn)物能夠抑制同型噬菌體對霍亂弧菌的再轉(zhuǎn)染，插入rstR基因能進一步降低疫苗候選株重獲毒力的可能性，提高其生物安全性，而ctxB基因編碼的霍亂毒素B亞單位能賦予機體針對疫苗的抗毒免疫能力。綠色熒光蛋白（GFP）來自維多利亞水母發(fā)光蛋白，在波長為395-498nm的紫外線激發(fā)下發(fā)光。重組綠色熒光蛋白（GFPuv）基因在質(zhì)粒pGFP上，由大腸桿菌表達。GFPuv由野生GFP經(jīng)點突

9、變而來，氨基酸位置Ser取代Phe99，Thr取代Met153，Ala取代Val163。GFPuv在大腸桿菌中比野生GFP表達快，所發(fā)熒光比野生GFP亮，紫外線激發(fā)波長為360～400nm。GFPuv，大小為27道爾頓，是由238個氨基酸組成的球狀蛋白質(zhì)，在pH5．5-11．5穩(wěn)定，最佳pH為8．0。綠色熒光蛋白整合進疫苗候選株染色體后，菌體在360～400nm紫外激發(fā)下發(fā)綠色熒光，從而有利于在環(huán)境中檢測疫苗候選株。 研究方法:

10、 1．引物設計根據(jù)GenBank上公布的O1群El Tor型霍亂弧菌國際標準株N16961及pGFPuv全序列設計引物。 2．串聯(lián)霍亂弧菌主要毒力基因簇上下游片段及氯霉素抗性基因自殺質(zhì)粒的構建PCR擴增霍亂弧菌主要毒力基因簇TLC-CTX-RTX的TLC上游片段（TLCu p）、RTX下游片段（RTXdown），克隆入pU18中，再在兩者間插入氯霉素抗性（cat）基因，獲得重組質(zhì)粒pUC18-TLCup-cat-RTXd

11、own。酶切回收TLCup-cat-RTXdown片段，克隆入自殺質(zhì)粒pDS132，構建重組自殺質(zhì)粒pDS132-TLCup-cat-RTXdown。 3．霍亂弧菌主要毒力基因簇TLC-CTX-RTX缺失株9693-1的篩選通過接合將重組自殺質(zhì)粒pDS132-TLCup-cat-RTXdown轉(zhuǎn)入O139群霍亂弧菌ZJ199693，20%蔗糖選擇培養(yǎng)基（氯霉素抗性）篩選TLC、CTX、RTX基因缺失株，然后再通過PCR、測序驗證

12、。 4．串聯(lián)霍亂弧菌主要毒力基因簇上下游片段、rstR和ctxB基因自殺質(zhì)粒的構建PCR擴增霍亂弧菌主要毒力基因簇TLC-CTX-RTX的TLC上游片段（TLCup）、RTX下游片段（RTXdown），克隆入pU18中，再在兩者間插入rstR和ctxB基因，獲得重組質(zhì)粒pUC18-TLCup-rstR-ctxB-RTXdown。酶切回收TLCup-rstR-ctxB-RTXdown片段，克隆入自殺質(zhì)粒pCVD442，構建重組自殺

13、質(zhì)粒pCVD442-TLCup-rstR-ctxB-RTXdown。 5．疫苗候選株O139-45的篩選及鑒定通過接合將重組自殺質(zhì)粒pCVD442-TLCup-rstR-ctxB-RTXdown轉(zhuǎn)入TLC、CTX、RTX基因缺失株，20%蔗糖選擇培養(yǎng)基篩選cat基因被rstR和ctxB基因替換了的重組改造菌株，然后再通過PCR、測序驗證。 6．兔腸段結扎試驗測CT毒性ctxAB基因編碼霍亂腸毒素CT，是引起霍亂的最主要因

14、子。將霍亂弧菌注射入結扎了的兔腸段中，通過第二天觀察腸段是否有充血、積液而判定該霍亂弧菌是否產(chǎn)毒。 7．Hep-2細胞毒性試驗測RTX毒素RTX毒素能使Hep-2細胞肌動蛋白交聯(lián)而致細胞圓縮，因此我們通過Hep-2細胞毒性試驗檢測度毒力基因缺失株的細胞毒性是否消失。 8．GM1-ELISA測CTB蛋白CT毒素B亞單位（CTB）能與神經(jīng)節(jié)苷脂GM1特異性結合，因此我們用GM1-ELISA檢測重獲ctxB基因的重組菌株的CT

15、B表達情況。 9．串聯(lián)溶血素上下游及綠色熒光蛋白基因的自殺質(zhì)粒的構建PCR擴增溶血素hlyA基因上游片段（hlyAup）、hlyA下游片段（hlyAdown），克隆入pU18中，再在兩者間插入lacz-GFPuv基因，獲得重組質(zhì)粒pUC18-hlyAup-laczGFPuv-hlyAdown。PCR擴增hlyAup-laczGFPuv-hlyAdown片段并將其酶切克隆入自殺質(zhì)粒pCVD442，構建重組自殺質(zhì)粒pCVD442-h

16、lyAup-laczGFPuv-hlyAdown。 結論: 1．O139群霍亂弧菌基因工程減毒活疫苗候選株的構建構建了出發(fā)株ZJ199693染色體上毒力相關基因簇TLC、CTX、RTX被保護性基因rstR及抗原基因ctxB替換的重組改造菌株O139-45，可作為疫苗候選株作進一步的免疫效果考核。 2． O139群霍亂弧菌基因工程減毒活疫苗候選株的初步評價家兔小腸腸段結扎測毒試驗顯示缺失株9693-1和疫苗候選株O

17、139-45明顯減毒，9693-1和O139-45的最主要毒力基因ctxAB被缺失。Hep-2細胞毒性試驗顯示缺失株9693-1對Hep-2細胞毒性作用消失。GM1-ELISA顯示O139群霍亂弧菌減毒活疫苗候選株O139-45的ctxB基因表達良好。 3．串聯(lián)溶血素上下游及綠色熒光蛋白基因的自殺質(zhì)粒構建構建了綠色熒光蛋白表達良好的重組自殺質(zhì)粒pCVD442-hlyAup-laczGFPuv-hlyAdown，可用于進一步對疫苗