葛根芩連湯血清藥化學(xué)研究.pdf

1、中藥復(fù)方葛根芩連湯源于《傷寒論》，處方由葛根、黃芩、黃連和甘草四味中藥組成，具有解表清里、升清止利之效。傳統(tǒng)中藥復(fù)方研究主要針對(duì)單味及復(fù)方給藥后一個(gè)或數(shù)個(gè)有效成分進(jìn)行藥代動(dòng)力學(xué)研究，但這無(wú)法反映復(fù)方整體的體內(nèi)動(dòng)態(tài)過(guò)程?；谘逯泻械某煞植攀侵兴庴w內(nèi)的直接作用物質(zhì)，本研究采用血清藥化學(xué)的研究思路，以口服葛根芩連湯后的大鼠血漿為研究對(duì)象，將多種現(xiàn)代技術(shù)綜合應(yīng)用，從血清中分離、鑒定移行成分，研究其與傳統(tǒng)療效的相關(guān)性，并構(gòu)建血漿藥代指紋圖譜，

2、闡明體內(nèi)直接作用物質(zhì)的代謝及體內(nèi)的動(dòng)態(tài)過(guò)程。具體內(nèi)容分為以下四個(gè)部分： 1. 以大鼠口服葛根芩連湯后的血漿為研究對(duì)象，建立葛根芩連湯入血成分的分析方法：生物樣本中主要干擾分析測(cè)定的組分是蛋白質(zhì)。本研究通過(guò)實(shí)驗(yàn)篩選出甲醇沉淀血漿中蛋白的前處理方法，樣品經(jīng)氮?dú)獯蹈?，用甲醇?fù)溶后以12000 r/min的轉(zhuǎn)速離心后得到的樣品直接用于HPLC分析。通過(guò)優(yōu)化波長(zhǎng)和流動(dòng)相的pH等HPLC的條件，確定在270 nm的波長(zhǎng)下，用乙腈和20 mM

3、的乙酸銨溶液對(duì)大鼠血漿樣品進(jìn)行梯度洗脫。 2. 葛根芩連湯入血成分的歸屬：比較空白血漿加葛根芩連湯提取物、大鼠口服復(fù)方及各單藥后的含藥血漿色譜圖，對(duì)復(fù)方給藥后的入血成分進(jìn)行歸屬。借鑒指紋圖譜的研究思路，以保留時(shí)間為依據(jù)，對(duì)復(fù)方含藥血漿中的31個(gè)成分進(jìn)行歸屬，其中15個(gè)來(lái)源于中藥，13個(gè)為體內(nèi)代謝產(chǎn)物，3個(gè)為進(jìn)入體內(nèi)后產(chǎn)生的新物質(zhì)。 3. 建立了液相色譜-二極管陣列-質(zhì)譜聯(lián)用（HPLC-DAD-MS）對(duì)大鼠口服葛根芩連湯后

4、的血漿樣品分析鑒定的方法：首先根據(jù)葛根素、黃芩苷、小檗堿、巴馬汀和藥根堿這五個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品來(lái)優(yōu)化質(zhì)譜條件，在質(zhì)譜正負(fù)離子模式下分別進(jìn)樣分析，根據(jù)保留時(shí)間、紫外最大吸收波長(zhǎng)和正負(fù)離子模式下的荷質(zhì)比，經(jīng)與標(biāo)準(zhǔn)品或是參考文獻(xiàn)比對(duì)，初步鑒定或推測(cè)出大鼠口服葛根芩連湯后血漿中的14種原型藥物成分，分別為葛根素、3’-甲氧基葛根素、8-C-芹糖基（1→6）葡萄糖-大豆苷元、大豆苷元、黃芩苷、漢黃芩苷、芹糖基-7-O-β-D-葡萄糖酐酸、木蝴蝶素A-7-O

5、-β-D-葡萄糖苷酸、藥根堿、黃連堿、小檗堿、巴馬汀、甘草酸、甘草苷。黃酮類化合物在體內(nèi)容易發(fā)生首過(guò)效應(yīng)，葡萄糖醛酸化是血漿中主要的代謝途徑，本研究推測(cè)出4種代謝產(chǎn)物，分別為大豆苷元-7-O-β-D-葡萄糖苷酸、大豆苷元4’-O-硫酸酯、黃芩素-6-O-β-葡萄吡喃糖醛酸苷、6-O-甲基-黃芩素-7-O-硫酸酯，這些成分的鑒定有助于闡明葛根芩連湯的藥效物質(zhì)基礎(chǔ)。 4. 構(gòu)建血漿藥代指紋圖譜，并首次將化學(xué)計(jì)量學(xué)用于葛根芩連湯入血成

6、分的經(jīng)時(shí)變化過(guò)程的研究：首先對(duì)含藥血漿的色譜方法進(jìn)行方法學(xué)考察，構(gòu)建血漿藥代指紋圖譜，結(jié)果表明其穩(wěn)定性好，重復(fù)性高，適合藥代動(dòng)力學(xué)的研究。進(jìn)而連續(xù)考察了大鼠口服葛根芩連湯后48 h內(nèi)，12種主要成分在體內(nèi)的動(dòng)態(tài)變化過(guò)程。其中葛根的主要成分葛根素代謝較快，達(dá)峰時(shí)間為1 h，給藥后10 h基本代謝完畢；甘草中有部分化合物的達(dá)峰時(shí)間1-1.5 h；而黃芩中的主要成分黃芩苷則出現(xiàn)雙峰現(xiàn)象，達(dá)峰時(shí)間分別為2、10 h，有部分化合物因其結(jié)構(gòu)與黃芩苷

7、相似，與體內(nèi)的肝腸循環(huán)有關(guān)而呈現(xiàn)不規(guī)則的多峰現(xiàn)象。將不同時(shí)間采血點(diǎn)的色譜數(shù)據(jù)導(dǎo)入SIMCA-P軟件進(jìn)行主成分分析（PCA），通過(guò)PCA得分圖可以清楚地區(qū)分不同采血時(shí)間色譜圖的差異，通過(guò)偏最小二乘法（PLS）可以更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)引起葛根芩連湯入血成分的經(jīng)時(shí)變化的主要因素，從而有助于揭示葛根芩連湯的時(shí)效關(guān)系。 本文通過(guò)液相色譜、二極管陣列和質(zhì)譜聯(lián)用等方法，對(duì)葛根芩連湯進(jìn)行血清藥化學(xué)研究，對(duì)口服葛根芩連湯后大鼠血漿中的化學(xué)成分進(jìn)行分離、歸