骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓衰竭小鼠體內(nèi)的歸巢及療效觀察.pdf

1、研究背景和目的:
　　 在我國(guó)，因各種原因?qū)е碌墓撬柙煅δ苷系K性疾病比較常見。近年隨著環(huán)境污染的加劇，各類電子設(shè)備的普及以及室內(nèi)裝修的復(fù)雜化，這類疾病的患者的數(shù)量有明顯的上升，成為嚴(yán)重威脅生命的疾病。骨髓衰竭綜合征(Bonemarrowfailuresyndromes，BMFS)是一組源于造血干細(xì)胞水平損傷的骨髓衰竭疾病，累及血細(xì)胞一系或多系。骨髓衰竭性疾病包括先天遺傳性和獲得性兩大類。遺傳性骨髓衰竭綜合征因骨髓造血干細(xì)胞增殖

2、、分化障礙及造血微環(huán)境異常所致，是以骨髓衰竭、癌癥傾向及先天畸形為表現(xiàn)的一組疾病，可表現(xiàn)為全血細(xì)胞減少，如范可尼貧血(FA)，先天性角化不良(DC)，Shwachman-Diamond綜合征(SDS)，也可表現(xiàn)為單系細(xì)胞減少，如先天性巨核細(xì)胞性發(fā)育不良血小板減少(CAMT)，Diamond-Blackfan貧血(DBA);獲得性骨髓衰竭疾病由后天細(xì)胞免疫紊亂造血微環(huán)境異常、造血細(xì)胞生長(zhǎng)因子分泌異常引起，其中以獲得性再生障礙性貧血(Apl

3、asticanemia，AA，簡(jiǎn)稱再障)最常見。
　　 再障是血液系統(tǒng)常見的疾病，是由多種病因、多種發(fā)病機(jī)理引起的骨髓造血功能衰竭的一種綜合病癥，基本病變?yōu)楣撬柙煅杉?xì)胞及造血微環(huán)境損傷，免疫功能紊亂，骨髓脂肪化，紅髓容量減少，導(dǎo)致造血功能衰竭，外周血全血細(xì)胞減少，繼發(fā)嚴(yán)重感染、出血和貧血而危及患者生命。再障成為困擾醫(yī)療界的一大難題，骨髓移植是治療再障首選措施，但由于受年齡及來(lái)源限制，免疫抑制劑和雄激素類藥物，存在副作用大復(fù)發(fā)率

4、高的問題。目前對(duì)免疫抑制治療無(wú)效或復(fù)發(fā)的患者尚缺乏有效治療方法，臨床上亟待探索新的治療手段。
　　 間充質(zhì)干細(xì)胞(Mesenchymalstemcells，MSCs)是一種具有多分化潛能的非造血干細(xì)胞，為中胚層來(lái)源的多能干細(xì)胞，主要存在于全身結(jié)締組織和器官間質(zhì)中，以骨髓組織中含量最為豐富。骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(Bonemarrowmesenchymalstemcells，BMSCs)具有多向分化的潛力，獲取方便，易于分離培養(yǎng)和鑒定、

5、旁分泌效應(yīng)、促進(jìn)血管生成、免疫調(diào)節(jié)和免疫耐受功能等優(yōu)點(diǎn)，因其不涉及倫理道德問題，被認(rèn)為是最有希望用于治療多種疾病的干細(xì)胞。BMSCs是構(gòu)成骨髓微環(huán)境的重要組成成分，主要功能是參與造血干細(xì)胞的生存和分化，維持造血微環(huán)境，不僅可表達(dá)多種造血細(xì)胞因子，具有支持造血功能，還具有免疫調(diào)節(jié)的特性。AA患者的BMSCs存在質(zhì)和量的異常，其造血支持和免疫調(diào)節(jié)存在缺陷。BMSCs因具有支持造血及免疫調(diào)節(jié)的雙重作用，在骨髓衰竭疾病的細(xì)胞治療中可能發(fā)揮重要作

6、用。
　　 BMSCs本身具有較低的免疫原性，且具有可移植性，異基因BMSCs不但可以進(jìn)入受體體內(nèi)，而且可在體內(nèi)較長(zhǎng)期存在。BMSCs歸巢是指自體的或外源性的BMSCs在多種因素的作用下穿過內(nèi)皮細(xì)胞定向遷移至靶向組織血管并定植的過程。因其具有多器官歸巢、優(yōu)先定位于受損傷靶器官、參與細(xì)胞分化及免疫調(diào)節(jié)等特點(diǎn)，已被廣泛應(yīng)用于allo-HSCT后GVHD的預(yù)防與治療、器官移植后排斥反應(yīng)的預(yù)防以及組織工程及各種自身免疫性疾病的治療等方面

7、。目前有關(guān)BMSCs在體內(nèi)存活及歸巢的機(jī)制尚未明確，已開展的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)研究中BMSCs的輸注量、途徑、移植模型的建立等方面均存在明顯差異，從而導(dǎo)致BMSCs在體內(nèi)分布不同，嚴(yán)重影響B(tài)MSCs的臨床應(yīng)用。但目前有關(guān)靜脈輸注BMSCs在骨髓衰竭模型體內(nèi)歸巢與分布的研究較少，其發(fā)揮治療作用的具體機(jī)制尚不清楚。因此本實(shí)驗(yàn)在成功分離純化、傳代培養(yǎng)和擴(kuò)增小鼠BMSCs的基礎(chǔ)上，以免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭模型為基礎(chǔ)，觀察靜脈輸注同種異體BMSCs對(duì)骨髓衰竭小

8、鼠模型的治療效果，并應(yīng)用親脂性膜熒光染料氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)標(biāo)記BMSCs，探討B(tài)MSCs是否在同基因正常小鼠與骨髓衰竭模型中的歸巢及遷移方面存在的差異。
　　 本研究包括三部分內(nèi)容:小鼠BMSCs的分離、培養(yǎng)及鑒定;BMSCs對(duì)骨髓衰竭模型造血和免疫功能的影響;BMSCs在骨髓衰竭小鼠體內(nèi)的分布與歸巢研究。
　　 第一部小鼠骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞的體外培養(yǎng)和生物學(xué)特性
　　 目的:
　　 分離和培養(yǎng)

9、小鼠BMSCs，研究其生物學(xué)特征，為動(dòng)物實(shí)驗(yàn)做準(zhǔn)備。
　　 方法:
　　 取4周齡正常雄性BALB/c小鼠的股骨，無(wú)菌狀態(tài)下沖洗骨髓腔，收集骨髓細(xì)胞懸液，接種于塑料培養(yǎng)皿，每3-4天按照1:3進(jìn)行常規(guī)方法傳代;倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)學(xué)特點(diǎn)，流式細(xì)胞儀檢測(cè)BMSCs的表面標(biāo)志，誘導(dǎo)BMSCs向成骨細(xì)胞及成脂細(xì)胞培養(yǎng)及鑒定。
　　 結(jié)果:
　　 小鼠BMSCs貼壁生長(zhǎng)后形態(tài)較均一，細(xì)胞形態(tài)呈成纖維細(xì)胞樣，P

10、3代細(xì)胞流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè):CD29為97.23％，CD44為99.67％，CD90為53.75％，CD105為29.83％;造血系抗原低表達(dá):CD34為4.12％，HLA-DR為5.40％，可向成骨細(xì)胞及成脂細(xì)胞分化。
　　 結(jié)論:
　　 全骨髓細(xì)胞貼壁培養(yǎng)法可成功分離和培養(yǎng)出小鼠BMSCs，分離所得的細(xì)胞性狀穩(wěn)定、狀態(tài)良好，形態(tài)學(xué)和表型，分化符合BMSCs特點(diǎn)。
　　 第二部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞對(duì)骨髓衰竭小鼠的造血

11、和免疫功能的影響
　　 目的:
　　 探討同種異體BMSCs對(duì)骨髓衰竭小鼠造血和免疫功能的影響。
　　 方法:
　　 將健康10周齡SPF級(jí)雌性BALB/c小鼠30只隨機(jī)分為3組，每組10只，分別為空白對(duì)照組（A組）、骨髓衰竭模型組（B組）、MSCs治療組（C組）。采用免疫介導(dǎo)方法建立(60Coγ-射線照射后輸入淋巴細(xì)胞)骨髓衰竭小鼠模型。BALB/c小鼠經(jīng)5Gyγ射線照射后，輸入5×106個(gè)DBA/2小

12、鼠的淋巴結(jié)細(xì)胞制成骨髓衰竭模型。于第3天將BMSCs經(jīng)尾靜脈輸注給C組小鼠，B組經(jīng)尾靜脈僅輸注等量的PBS液。小鼠瀕死或造模第14天，觀察各組小鼠的平均生存時(shí)間、外周血血像和骨髓形態(tài)學(xué)特征。采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)外周血T淋巴細(xì)胞亞群，分析CD3+CD4+、CD3+CD8+T細(xì)胞的百分率，CD4+/CD8+比值。ELISA方法檢測(cè)外周血上清細(xì)胞因子IFN-γ和IL-2的水平。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:
　　 計(jì)量資料以(x)±s表示

13、，應(yīng)用SPSS13.0軟件完成統(tǒng)計(jì)處理，生長(zhǎng)曲線采用兩獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)的比較采用單因素方差分析法，兩兩比較采用Bonforroni法，繪制Kaplan-Meier生存函數(shù)曲線并對(duì)其進(jìn)行LogRank檢驗(yàn)，P＜0.05為差異有顯著性意義。
　　 結(jié)果:
　　 小鼠瀕死或造模第14天，C組比B組平均生存時(shí)間顯著延長(zhǎng)(P=0.035)，C組的外周血象和骨髓細(xì)胞與B組相比顯著升高。C組與B組相比，CD3+CD4+百分比、

14、CD3+CD8+百分比、CD4+/CD8+比值顯著升高(P＜0.001)。C組與B組比較，IFN-γ和IL-2含量顯著降低.(P=0.011;P=0.036)。
　　 結(jié)論:
　　 BMSCs能促進(jìn)骨髓衰竭小鼠的造血恢復(fù)，減輕骨髓衰竭程度，調(diào)節(jié)免疫功能，抑制造血負(fù)調(diào)控因子的活性，對(duì)骨髓衰竭有治療作用
　　 第三部分骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞在骨髓衰竭小鼠體內(nèi)的歸巢的研究
　　 目的:
　　 探討同種異體BM

15、SCs在骨髓衰竭小鼠和正常小鼠體內(nèi)歸巢是否存在差別。
　　 方法:
　　 在體外以標(biāo)記CM-Dil的BMSCs作為實(shí)驗(yàn)組，以未標(biāo)記CM-Dil的BMSCs作為對(duì)照組，比較兩組細(xì)胞生長(zhǎng)與增殖情況，MTT法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)增殖情況。健康10周齡SPF級(jí)BALB/c小鼠20只，隨機(jī)分為4組，每組5只，分別為對(duì)照A組、對(duì)照B組、骨髓衰竭模型A組、骨髓衰竭模型B組，采用免疫介導(dǎo)方法建立（60Coγ-射線照射后輸入淋巴細(xì)胞）骨髓衰竭小鼠

16、模型。以同基因正常小鼠及免疫介導(dǎo)的骨髓衰竭小鼠為基礎(chǔ)，將親脂性膜熒光染料氯甲基苯甲酰氨(CM-Dil)標(biāo)記的BMSCs于第3天經(jīng)尾靜脈注射各組小鼠體內(nèi)。分別于不同時(shí)間點(diǎn)處死小鼠取骨髓制成單個(gè)核細(xì)胞懸液，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測(cè)CM-DiI陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞的分布比例，熒光顯微鏡分別觀察供體細(xì)胞在各受鼠體內(nèi)的分布。
　　 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理:
　　 計(jì)量資料以(x)±s表示，應(yīng)用SPSS13.0軟件完成統(tǒng)計(jì)處理，采用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05為

17、差異有顯著性意義。
　　 結(jié)果:
　　 體外培養(yǎng)結(jié)果顯示，兩組BMSCs在細(xì)胞生長(zhǎng)、增殖、分裂以及形態(tài)學(xué)上均基本相似，在綠色光激發(fā)下，CM-Dil發(fā)出紅色熒光，24小時(shí)后細(xì)胞標(biāo)記率為95％，14天后CM-Dil標(biāo)記的BMSCs熒光仍清晰可見。BMSCs移植后24小時(shí)和第7天，骨髓衰竭模型組骨髓中CM-DiI陽(yáng)性標(biāo)記細(xì)胞均多于對(duì)照組(t=-18.597，P＜0.001;t=-24.444，P＜0.001)，對(duì)照B組CM-D