水稻CDPK家族基因結(jié)構(gòu)、鹽脅迫下的表達(dá)特性和重要基因遺傳轉(zhuǎn)化.pdf

1、CDPK是植物特有的一類絲氨酸/蘇氨酸型蛋白激酶，在介導(dǎo)植物生育信號和逆境信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中具有重要作用。迄今，有關(guān)水稻CDPK的研究尚缺乏系統(tǒng)報道。鑒于此，本項研究通過對水稻基因組搜索，獲得了22個水稻CDPK基因。通過現(xiàn)代分子生物學(xué)和生物信息學(xué)技術(shù)，研究了上述水稻CDPK基因的結(jié)構(gòu)特征、在鹽分逆境脅迫條件下的時空表達(dá)特性和部分基因啟動子及基因的功能。主要研究結(jié)果如下: 1、水稻CDPK基因(OsCDPK1～OsCDPK4、OsCDP

2、K6～OsCDPK21、OsCDPK23、OsCDPK24)在基因結(jié)構(gòu)特征上存在明顯差異。各基因成員在DNA序列長度、eDNA全長序列、開放閱讀框和翻譯的氨基酸數(shù)量上變幅較大。聚類分析發(fā)現(xiàn)，水稻CDPK基因可劃分為2個亞組。 2、部分水稻CDPK基因在正常生長條件和鹽分脅迫條件下表現(xiàn)為組成型表達(dá)，包括OsCDPK4、OsCDPK18、OsCDPK19和OsCDPK24；OsCDPK10和OsCDPK16在根葉中表達(dá)受到鹽分脅迫的

3、調(diào)控。OsCDPK6，OsCDPK20和OsCDPK13在鹽分處理后表現(xiàn)為葉片中特異上調(diào)表達(dá)。對OsCDPK6和OsCDPK20的表達(dá)隨鹽分處理時間的變化研究發(fā)現(xiàn)，上述基因的表達(dá)均表現(xiàn)為單峰曲線特征，以處理1h表達(dá)水平最高。表明水稻許多CDPK基因介導(dǎo)了鹽分脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程。 3、在克隆OsCDPK19啟動子的基礎(chǔ)上，采用DNA重組技術(shù)，構(gòu)建了由OsCDPK19啟動子驅(qū)動報告基因(β-葡萄糖醛酸酶基因，GUS)表達(dá)的表達(dá)載體p

4、CAM3301-OsCDPK19。對遺傳轉(zhuǎn)化后的煙草研究發(fā)現(xiàn)，OsCDPK19啟動子能驅(qū)動報告基因高水平表達(dá)，且表現(xiàn)為葉片和莖桿維管組織優(yōu)勢表達(dá)的特征。研究表明，在-296bp～-623 bp和-623 bp～-989 bp，具有增強(qiáng)子的存在；在-989 bp～-1474 bp中的AC-Ⅱ、AC-Ⅲ元件相似的基序(分別為ACCAACC和GTTAGGT)，可能是調(diào)控下游基因呈維管組織中優(yōu)勢表達(dá)的調(diào)控元件。 4、由于OsCDPK6基

5、因在葉片中的表達(dá)受到鹽分脅迫的明顯誘導(dǎo)，表明該基因可能介導(dǎo)葉片中鹽分脅迫信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)過程?；诖?，作者通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化法，建立了超表達(dá)OsCDPK6基因的煙草轉(zhuǎn)基因系。研究發(fā)現(xiàn)，在鹽分脅迫條件下，上調(diào)表達(dá)OsCDPK6的轉(zhuǎn)基因煙草植株，與對照相比耐鹽能力明顯改善。表現(xiàn)為經(jīng)過7 d的鹽分處理后，轉(zhuǎn)基因系植株較對照植株傷害小、單株綠葉面積多。與對照相比，轉(zhuǎn)基因系葉片的SOD活性增加，丙二醛(MDA)含量降低；葉綠素a、b含量、類胡蘿卜

6、素含量、可溶性糖含量和可溶蛋白含量明顯增加。表明植株細(xì)胞保護(hù)代謝途徑響應(yīng)了OsCDPK6介導(dǎo)的鹽分逆境信號過程。OsCDPK6在增強(qiáng)植株抵御鹽分脅迫的能力中具有較重要的作用。 5、OsCDPK6在葉片中的表達(dá)表現(xiàn)為明顯的鹽分誘導(dǎo)特性，推測該基因的啟動子具有驅(qū)動下游基因在鹽分脅迫條件下增強(qiáng)表達(dá)的功能，在作物耐鹽轉(zhuǎn)基因品種的創(chuàng)制中具有重要價值。基于此，作者對OsCDPK6基因的啟動子進(jìn)行了克隆，采用基因遺傳轉(zhuǎn)化技術(shù)，在煙草中鑒定了該

7、啟動子的功能和驅(qū)動靶基因的表達(dá)特征。研究表明，遺傳轉(zhuǎn)化OsCDPK6啟動子的轉(zhuǎn)基因植株，根和葉進(jìn)行X-gluc組織化學(xué)染色的特征，與對OsCDPK6基因在正常生長和鹽分處理條件下水稻根、葉中的表達(dá)特征相一致。鹽分處理后在莖、葉的組織染色程度較對照明顯加深，驅(qū)動報告基因的表達(dá)為組成型。在OsCDPK6的啟動子中，含有1個MYC轉(zhuǎn)錄因子識別序列和3個MYB轉(zhuǎn)錄因子核心識別序列。研究表明，鹽分脅迫誘導(dǎo)的OsCDPK6在葉片中的增強(qiáng)表達(dá)，可能是