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1、中國醫(yī)科大學(xué)碩士學(xué)位論文幼鼠腸缺血再灌注損傷中腫瘤壞死因子的實驗研究姓名:李春艷申請學(xué)位級別:碩士專業(yè):兒科學(xué)指導(dǎo)教師:于明2000.4.1分鐘組(1120’G)。3標(biāo)本采集及處理:(1)腸管、肝組織置于10%福爾馬林液中固定。(2)經(jīng)殷動脈、門靜脈取血離心,血清于70℃冰箱保存。(3)肝、腸組織取材后放人DEPC處理過的Eppendor[管中后置于一70℃冰箱保存。實驗方法1檢測方法:1)免疫組織化學(xué)法:腸、肝組織常規(guī)固定,石蠟包埋,
2、切片,用羊抗TNF—a多克隆抗體和過氧化物酶標(biāo)記的鏈酶卵白素(SP)染色試劑盒檢測TNF—n蛋白陽性細(xì)胞存在。2)病理組織學(xué):腸組織切片進(jìn)行蘇木素一伊紅染色(HE),觀察不同I/R時點腸組織病理變化。3)放射免疫法:根據(jù)待測樣品TNF一0t和1125標(biāo)記TNFa競爭性與特異性抗體相結(jié)合原理,采用液相競爭放射免疫法檢測血清中TNF—a的濃度。4)RT—PCR半定量測定:用TRI—ZOL總RNA提取試劑提取腸組織總RNA,反轉(zhuǎn)錄合成cDNA
3、第一鏈,分別擴增TNF—a、c—losPCR產(chǎn)物,檢測腸組織TNF—amRNA、c—losmRNA表達(dá)。2結(jié)果判定及數(shù)據(jù)處理:1)免疫組織化學(xué)結(jié)果半定量判定:陽性強度按顯色深度和陽性顆粒的大小、數(shù)量分為陰性(一)、可疑()、陽性()、強陽性()、極強陽性(H~抖持)。2腸組織HE染色后腸粘膜損傷按Chiu氏六級評分評價。3)樣品血清濃度用Xs表示,組問樣本均數(shù)進(jìn)行t檢驗。4)以內(nèi)參照值標(biāo)準(zhǔn)化TNF—a、c—los值,得到TNF—a、c—
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