靶向于β淀粉樣蛋白的先導(dǎo)化合物篩選及其相互作用.pdf

1、阿爾茨海默?。╝lzheimerdisease，AD）是臨床常見(jiàn)的癡呆類(lèi)型，其主要病理改變?yōu)槔夏臧吆蜕窠?jīng)元纖維纏結(jié)。β淀粉樣蛋白級(jí)聯(lián)反應(yīng)假說(shuō)是目前關(guān)于AD發(fā)病機(jī)制較為公認(rèn)的學(xué)說(shuō)，其基本觀點(diǎn)認(rèn)為，β淀粉樣蛋白(amyloidbeta,Aβ)的沉積、聚集是AD發(fā)病的始發(fā)因素，而其他病理特征如tau蛋白的高度磷酸化以及隨后的神經(jīng)元纖維纏結(jié)等都與Aβ沉積有關(guān)。因此，從理論上講，若能找到有效且可靠的抑制Aβ聚集的試劑或藥物，將有可能減少由Aβ纖維

2、導(dǎo)致的神經(jīng)元變性及其他病理改變，從而抑制或阻止AD的病程發(fā)展。
　　 Aβ是一個(gè)含有40-42個(gè)氨基酸的多肽，為β淀粉樣蛋白前體蛋白的水解產(chǎn)物。生理?xiàng)l件下Aβ是可溶的，而在病理狀態(tài)下Aβ可在神經(jīng)組織中形成致密纖維狀的聚合體，成為不溶性的Aβ，并表現(xiàn)出神經(jīng)毒性。研究表明，不同的Aβ片段如Aβ1-40和Aβ1-42具有不同的聚集特性，而且在不同的條件下合成的Aβ纖維結(jié)構(gòu)不同提示了Aβ纖維的多形性真實(shí)存在，并已通過(guò)固態(tài)核磁共振(nuc

3、learmagneticresonance，NMR)等技術(shù)得以證明。因而，探索合適的實(shí)驗(yàn)環(huán)境，包括溫度的影響對(duì)于研究Aβ的特點(diǎn)及靶向于Aβ的藥物是十分必要的。
　　 本研究采用改良的等溫滴定微量熱（isothermaltitrationcalorimetry，ITC）、圓二色譜（circulardichroismspectra,CD）和原子力顯微鏡(atomicforcemicroscope，AFM)等方法觀察了Aβ1-40和A

4、β1-42在不同溫度下靜置、無(wú)攪拌狀態(tài)下的聚集過(guò)程，確定了穩(wěn)定的體外實(shí)驗(yàn)條件。在此基礎(chǔ)上，利用表面等離子共振技術(shù)(surfaceplasmonresonance，SPR)對(duì)本課題組根據(jù)構(gòu)效關(guān)系設(shè)計(jì)并合成的大量化合物進(jìn)行了抗Aβ聚集活性的初步篩選，并以白藜蘆醇(resveratrol，RES)為代表，對(duì)部分具有Aβ抗聚集活性的化合物進(jìn)行了功能確定，最后擬通過(guò)脂多糖(lipopolysaccharide，LPS)腹腔注射的方法建立ICR小鼠

5、學(xué)習(xí)記憶障礙模型并研究RES對(duì)其影響。結(jié)果表明:
　　 1.4℃的實(shí)驗(yàn)溫度持續(xù)24h，單體Aβ1-40和Aβ1-42均不發(fā)生熱力學(xué)改變，而25℃和37℃條件下單體Aβ1-40和Aβ1-42靜置24h內(nèi)均顯示吸熱的熱力學(xué)過(guò)程;結(jié)合CD及AFM的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，提示4℃的實(shí)驗(yàn)溫度下，單體Aβ1-40和Aβ1-42都不發(fā)生自我聚集，而在25℃和37℃的實(shí)驗(yàn)條件下，Aβ1-40和Aβ1-42都出現(xiàn)了明顯的熱力學(xué)改變、二級(jí)結(jié)構(gòu)改變和粒徑大小的改

6、變，表明25℃和37℃下Aβ1-40和Aβ1-42都可以發(fā)生自我聚集。
　　 2.利用表面等離子共振技術(shù)，首先證實(shí)了剛果紅和硫黃素S可以與單體及纖維狀A(yù)β1-40和Aβ1-42結(jié)合，提示表面等離子共振技術(shù)可以用于抗淀粉樣蛋白聚集化合物的初步篩選。
　　 3.通過(guò)表面等離子共振技術(shù)，待選化合物中僅有部分能與單體或纖維狀A(yù)β結(jié)合，但結(jié)合能力比CongoRed弱。而且相同濃度下，不同化合物與Aβ的結(jié)合能力和其與fAβ的結(jié)合能力

7、并不一致。這是否與其在聚集過(guò)程中存在二級(jí)結(jié)構(gòu)改變從而暴露出不同的結(jié)合位點(diǎn)有關(guān)？還有待進(jìn)一步研究證實(shí)。
　　 4.表面等離子共振技術(shù)證明，RES(1.56～100μM)能與單體及纖維狀A(yù)β結(jié)合;50μM與單體Aβ共孵后，反應(yīng)體系的硫黃素T熒光強(qiáng)度減弱;1H-NMR結(jié)果證實(shí)RES在與單體Aβ1-42或Aβ1-40共孵過(guò)程中存在波譜變化，其中與Aβ1-42共孵后在1.05ppm和1.72ppm處出現(xiàn)新峰，而與Aβ1-40共孵后則使1.

8、17ppm處的兩個(gè)峰消失，原子力顯微鏡進(jìn)一步證實(shí)共孵可使Aβ1-40和Aβ1-42自我聚集后的粒徑變小。提示RES能與單體Aβ1-40和Aβ1-42結(jié)合，干擾其自我聚集過(guò)程。
　　 5.AD人腦連續(xù)切片體外染色結(jié)果顯示，RES(10-4M)體外滴染可與腦片中的老年斑結(jié)合。
　　 6.LPS(250μg/kg)單次腹腔注射不能誘導(dǎo)ICR小鼠在Morris水迷宮試驗(yàn)中表現(xiàn)出學(xué)習(xí)記憶能力損傷，RES(10mg/kg)灌胃給藥2

9、1天對(duì)ICR小鼠在Morris水迷宮中的表現(xiàn)無(wú)明顯影響。但是，本研究結(jié)果提示ICR小鼠能完成Morris水迷宮實(shí)驗(yàn)任務(wù)，并存在性別差異，表現(xiàn)為雌性ICR小鼠在學(xué)習(xí)期找到逃生平臺(tái)的潛伏期低于雄性小鼠，記憶期則在目標(biāo)象限的停留時(shí)間高于雄性小鼠。
　　 本研究結(jié)果提示，25℃可用于纖維狀A(yù)β1-40和Aβ1-42的體外實(shí)驗(yàn);SPR方法可有效篩選抗Aβ聚集化合物;RES可干擾Aβ1-40和Aβ1-42的自我聚集過(guò)程并與老年斑結(jié)合，但其對(duì)