骨髓動員對外周血EPC變化及損傷動脈血管內膜修復的影響.pdf

1、動脈粥樣硬化伴有血管內皮功能的受損,在經皮冠狀動脈介入治療中也存在血管內皮的剝脫損傷和修復不全.血管內皮損傷和修復不全,是引起血管平滑肌細胞遷移和增殖的主要原因之一,也是經皮冠脈介入治療后支架內發(fā)生再狹窄的促發(fā)因素.現(xiàn)在有關防治再狹窄的研究較多,其主要針對的靶點是抑制平滑肌細胞的遷移和增殖.血管內放射治療和藥物洗脫支架通過射線或抗細胞增殖藥物作用,顯示可以明顯地抑制局部的血管平滑肌細胞過度增殖,在減少支架內再狹窄方面的效果較為顯著,以雷

2、帕霉素為代表的藥物洗脫支架已經在臨床上使用.但是,不管是血管內放射或者抗細胞增殖藥物,其對細胞增殖的抑制都是非特異性的,這將引起經皮介入治療后靶血管內皮修復不全,產生支架裸露、晚期支架內血栓形成等涉及遠期安全性的擔憂.在抑制血管平滑肌細胞增殖的同時,如果能促進血管內皮的修復,不但能減低介入治療后再狹窄的發(fā)生率,對改善血管的重塑、促進其功能恢復也將有重要意義.一般認為損傷血管的內皮修復是由損傷鄰近的內皮細胞增殖和遷移完成,但是血管損傷處周

3、圍的內皮細胞再生能力有限.隨著近年來對干細胞研究的深入,發(fā)現(xiàn)骨髓來源的干細胞不但參與成年個體出生后的血管新生和血管形成,而且有可能對損傷血管的內皮修復也有重要作用.已經有研究確定外周血中存在骨髓來源的內皮前體細胞,稱為內皮祖細胞(endothelial progenitor cell, EPC),EPC既能不斷擴增,又能定向分化為成熟的內皮細胞.目前鑒定EPC的方法有細胞培養(yǎng)、免疫磁珠分選和熒光流式細胞檢測法等;在進行雙色熒光標記流式細

4、胞檢測時,CD34+AC133+或者CD34+VEGFR2+雙陽性細胞比例基本可反映EPC的動態(tài)變化水平.正常生理狀態(tài)下外周血中EPC數(shù)量很少,缺血、血管損傷等因素可以使外周血中EPC數(shù)量增加,推測其可能與損傷血管的修復過程增強有關.增強骨髓向外周血釋放EPC的措施,稱為骨髓動員.已經有報道將異體的骨髓干細胞進行擴增以后,輸入血管損傷的動物模型,可以促進其損傷血管內皮的修復,但是藥物和細胞因子等外源性因素能否通過自體骨髓動員增加外周血中

5、EPC的數(shù)量,并促進損傷血管的內皮修復,尚未見更多的報道.如果能進一步揭示藥物等外源性調節(jié)因素對在體EPC的作用環(huán)節(jié)和調控機理,必將為防治血管再狹窄和促進損傷血管修復提供研究基礎.在冠心病的一級或二級預防中,他汀類藥物都有顯著的作用,除降低血中低密度脂蛋白膽固醇(LDL-C)水平以外,還顯示了改善血管內皮功能的效果;粒細胞集落刺激因子(Granulocyte Colony-stimulating factor,G-CSF)則可增加外周血

6、中各種前體細胞的數(shù)量,但是它們與循環(huán)中EPC的關系還知之甚少.該實驗擬在小鼠下肢缺血的基礎上給予辛伐他汀和G-CSF刺激,初步了解外周血中EPC數(shù)量的動態(tài)改變;然后在大鼠球囊損傷血管模型上采取類似的干預手段,觀察對損傷血管內皮修復和新生內膜增殖效應的影響.方法:1.小鼠下肢缺血及他汀藥物和細胞因子對外周血EPC的影響:參考文獻介紹的方法建立小鼠下肢缺血模型,再單獨或聯(lián)合給予辛伐他汀和G-CSF等藥物進行骨髓動員,術前、術后3天和術后7天

7、等不同的時間點取血,行外周血白細胞記數(shù)以了解骨髓動員的程度,同時進行外周血雙色熒光標記流式細胞檢測,測定CD34+VEGFR2+的比例,以反映在缺血及加用藥物刺激的情況下外周血EPC的變化水平.2.大鼠頸動脈球囊損傷模型建立及新生內膜形成觀察:用Forgaty球囊導管制備大鼠頸動脈內皮剝脫損傷模型,掃描電鏡觀察內皮剝脫效果.然后給予前述干預藥物,術后2周取血管行石臘切片HE染色和PCNA免疫組化染色觀察有無新生內膜增生及增生程度.3.大

8、鼠頸動脈球囊損傷及藥物和細胞因子干預后外周血CD34陽性細胞比例觀察:術后2周各組取外周血進行熒光標記流式細胞測定,了解CD34陽性細胞的比例,間接反映骨髓動員程度和外周血中EPC變化水平.4.大鼠頸動脈球囊損傷及藥物和細胞因子干預后血管內皮修復觀察:術后4周注射伊文氏藍評價血管內皮修復程度,同時測定血管環(huán)的最大舒張率和血管勻漿釋放NO的水平,以比較各組動物經藥物干預以后血管修復程度的功能差別.結果:1.小鼠下肢缺血及藥物干預后骨髓動員

9、程度和外周血EPC的變化:與對照組比較,缺血后小鼠外周血CD34和VEGFR2雙陽性細胞比例有輕度的增加;與單純缺血組相比,給予辛伐他汀對外周血白細胞數(shù)量沒有顯著的影響,給予辛伐他汀后CD34和VEGFR2雙陽性細胞比例較單純缺血組增加;同時給予辛伐他汀和G-CSF后不但使外周血白細胞數(shù)量明顯增加,而且CD34和VEGFR2雙陽性細胞比例也顯著增高,提示藥物和細胞因子等外源性刺激因素可以使骨髓動員增強,從而使外周血中EPC數(shù)量增加.各個

10、時相點中,CD34和VEGFR2雙陽性細胞比例以術后2周增加最明顯,反應外周血中EPC的數(shù)量變化有時間依賴性.2.大鼠頸動脈球囊損傷模型建立結果:大鼠頸動脈經球囊損傷后,掃描電鏡觀察證實有明顯血管內皮剝脫.在單純球囊損傷組,損傷后2周石臘切片HE染色見明顯的新生內膜增殖,血管腔明顯變狹窄.經PCNA組化染色發(fā)現(xiàn)中膜和新生內膜有較多PCNA陽性細胞,反映其中以平滑肌細胞為主的細胞成分增殖明顯.3.藥物和細胞因子干預對新生內膜增生程度的影響

11、:經辛伐他汀或G-CSF干預后,損傷血管的新生內膜增殖減輕,中膜和新生內膜中PCNA陽性細胞比例減低,代表新生內膜增生程度的內膜/中膜比值減小,其中以辛伐他汀合并G-CSF使用的效果最明顯,提示藥物干預有抑制大鼠球囊損傷后新生內膜增殖的效果. 4.藥物和細胞因子干預對損傷血管功能的影響:手術后4周,與單純球囊損傷組比較,損傷血管經藥物干預后在血管環(huán)張力實驗中表現(xiàn)出最大舒張率改善,血管勻漿釋放NO的水平增加,提示經藥物干預可以促進損傷血管

12、的內皮修復,內皮依賴性血管功能得到明顯改善.5.外周血EPC與血管內皮修復的關系:單獨給予辛伐他汀及合用辛伐他汀和G-CSF的兩組大鼠,外周血中經熒光標記流式細胞檢測CD34陽性細胞比例增加,在合用辛伐他汀和G-CSF組,CD34陽性細胞比例增加更明顯,同時損傷血管新生內膜增殖程度更輕.提示外周血中EPC可能參與損傷血管的內皮修復,而且其增加的水平與修復程度相關.結論:1.正常生理狀態(tài)下,外周血中存在極少量的EPC,骨髓動員可以增加外周