耐輻射式球菌雙鏈DNA修復(fù)系統(tǒng)RecF途徑的關(guān)鍵解旋酶DrRedcQ的結(jié)構(gòu)與功能研究.pdf

1、RecQ作為DNA解旋酶無論是從單細(xì)胞的細(xì)菌還是到人類對(duì)于基因組完整性的保持和維護(hù)都起到了十分重要的作用。與其他解旋酶家族類似，RecQ蛋白需要在ATP存在的情況下解旋雙鏈DNA。但是，不同于其他家族的解旋酶，RecQ蛋白有著不同尋常的廣泛的應(yīng)用活性，包括DNA復(fù)制，DNA重組和修復(fù)等1。人類如果缺失RecQ基因功能會(huì)引起癌癥易感性和早衰。因此，近些年來RecQ家族蛋白引起了廣泛的關(guān)注和研究，不僅僅是因?yàn)樗鼈儗?duì)基因組的不穩(wěn)定起到抑制作用

2、，更是因?yàn)榭梢员苊馊祟惖哪承┘膊　?br>　　 第一個(gè)RecQ家族的蛋白是由Nakayama and Umezu通過篩選大腸桿菌發(fā)現(xiàn)的抗胸腺嘧啶缺陷致死的菌株中發(fā)現(xiàn)的2,3。這個(gè)蛋白作用在RecF基因重組修復(fù)系統(tǒng)中。RecF通路參與同源重組和由紫外線誘導(dǎo)所致的DNA損傷修復(fù)中4。RecQ和RecF通路中的其他蛋白幫助修復(fù)停止在DNA損傷位點(diǎn)的復(fù)制叉5。RecQ蛋白在至今所有得到全基因組序列的生物中都得到了鑒定。三種保守的結(jié)構(gòu)域存在于R

3、ecQ家族蛋白中:Helicase（解旋酶），RecQ-C-terminal(RecQ-Ct)和Helicase-and-RNaseD-like-C-terminal(HRDC)6。在這三種保守結(jié)構(gòu)域中，HRDC結(jié)構(gòu)域形成一個(gè)獨(dú)立的螺旋束和參與DNA結(jié)合反應(yīng)，尤其是在某種程度上決定了DNA底物的特異性7,8。
　　 雙鏈DNA斷裂被認(rèn)為是最嚴(yán)重的基因組損傷。耐輻射式球菌(D.radiodurans)作為可以耐受極高強(qiáng)度的干旱和離

4、子損傷而造成的大范圍的DNA雙鏈斷裂而得到廣泛認(rèn)可。因此，其強(qiáng)大的輻射耐受性使耐輻射球菌成為一個(gè)研究DNA修復(fù)系統(tǒng)的模式生物7。相比于其他所有的RecQ家族的得到鑒定的蛋白質(zhì)，耐輻射式球菌D.radiodurans中的RecQ家族的蛋白DrRecQ在其蛋白質(zhì)序列的C端有三個(gè)HRDC結(jié)構(gòu)域。DrRecQ蛋白有著特殊結(jié)構(gòu)域分布的蛋白結(jié)構(gòu)引起了科研學(xué)者的廣泛興趣:這種細(xì)菌極高的輻射耐受及其高效的DNA損傷修復(fù)能力可能就是源于其蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的特殊

5、性。DrRecQ蛋白各個(gè)結(jié)構(gòu)域的截短變異體的體外生化實(shí)驗(yàn)證明在耐輻射式球菌中解旋酶和HRDC結(jié)構(gòu)域?qū)τ贒rRecQ蛋白質(zhì)功能的發(fā)揮都是至關(guān)重要的，并且這三個(gè)HRDC結(jié)構(gòu)域在整體功能的發(fā)揮上具有協(xié)同作用9。
　　 本文我們旨在闡明作為被證明是耐輻射式球菌中主要的雙鏈DNA重組修復(fù)系統(tǒng)的RecF途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶DrRecQ的真實(shí)功能和調(diào)節(jié)機(jī)制的研究。在這篇文章中，我們重點(diǎn)研究了DrRecQ全長蛋白和兩個(gè)截短的蛋白——DrRecQ1

6、-824(Helicase+RecQ-Ct+3 HRDC),DrRecQ1-610(Helicase+RecQ-Ct+HRDC1)andDrRecQ1-520(Helicase+RecQ-Ct)的結(jié)構(gòu)和生物化學(xué)功能的研究。作為一個(gè)解旋酶，在ATP不存在的情況下DrRecQ可以與不同種類的DNA底物結(jié)合，但是其結(jié)合能力的強(qiáng)弱以DNA底物的不同而有差異。當(dāng)ATP存在時(shí)，DrRecQ可以高效解旋雙鏈DNA和Holliday junction。

7、這里我們應(yīng)用凝膠電泳遷移分析(electrophoretic mobility shift assay，EMSA)實(shí)驗(yàn)來檢驗(yàn)DrRecQ和不同DNA底物的結(jié)合強(qiáng)弱及其解旋酶活性的檢測。另外，我們得到了以上三種蛋白的蛋白質(zhì)晶體。但是，DrRecQ全長的晶體結(jié)構(gòu)可能很難得到:因?yàn)镠RDC1和HRDC2之間的長Loop區(qū)可能會(huì)影響晶體的質(zhì)量，也很難對(duì)其整體的結(jié)構(gòu)進(jìn)行細(xì)致性的分析。小腳散射（Small Angel X-ray Scatterin

8、g，SAXS）是一種非常強(qiáng)大的生物大分子結(jié)構(gòu)檢測方法，尤其對(duì)接近于其生理狀態(tài)的溶液狀態(tài)的生物大分子的結(jié)構(gòu)分析更加有效。我們應(yīng)用小腳散射的目的首先是希望得到溶液狀態(tài)下全長的DrRecQ蛋白質(zhì)和DrRecQ1-610的結(jié)構(gòu)解析，再次進(jìn)行DrRecQ蛋白質(zhì)與不同種類的DNA底物的相互作用的研究，最后基于小腳散射的數(shù)據(jù)來對(duì)完整的分子結(jié)構(gòu)模型進(jìn)行構(gòu)建。目前我們通過對(duì)小腳散射的數(shù)據(jù)進(jìn)行解析對(duì)上述兩種蛋白質(zhì)中解旋酶和HRDC在溶液中的模型進(jìn)行了成功組

9、建。分離得到的部分DrRecQ蛋白質(zhì)的高分辨率結(jié)構(gòu)被應(yīng)用的小腳散射的數(shù)據(jù)當(dāng)中用來對(duì)比和建模。小腳散射的數(shù)據(jù)通過與DrRecQ1-610的對(duì)比得到了完整的DrRecQ1-824全長蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)。在溶液中兩種蛋白的解旋酶部分都是呈現(xiàn)圓形的結(jié)構(gòu)，但是與晶體結(jié)構(gòu)中不同的是在其中間有空洞出現(xiàn)。從我們得到的所有的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)推斷DrRecQ蛋白不僅僅可以在RecF途徑的第一步那樣解旋雙鏈的DNA底物，而且HRDC結(jié)構(gòu)域可以幫助DrRecQ蛋白與Holl