耐輻射奇球菌PprM蛋白靶DNA的篩選與鑒定.pdf

1、背景與目的：耐輻射奇球菌（Deinococcus radiodurans, DR）是地球上已知的耐受電離輻射最強(qiáng)的生物之一，能夠高度耐受電離輻射、紫外線、H2O2、干燥以及其他DNA理化損傷劑的損傷。pprM基因是 DR中功能未知的獨(dú)特基因，生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn) PprM擁有CSD結(jié)構(gòu)域(“Cold-shock”DNA-binding domain)，推測(cè)其可能是一種DNA結(jié)合蛋白，能夠與靶DNA結(jié)合而發(fā)揮相應(yīng)的生物學(xué)效應(yīng)。本研究擬應(yīng)用目

2、前在體內(nèi)研究蛋白質(zhì)-DNA相互作用的最佳的方法染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP）來(lái)篩選 PprM蛋白相互作用的靶 DNA，探索PprM與它們的調(diào)控關(guān)系。
　　方法：本研究通過(guò)設(shè)計(jì)并合成能夠擴(kuò)增 HA-pprM基因全長(zhǎng)的引物，以無(wú)突變的pGEX-6p-1-pprM載體為模版，PCR擴(kuò)增出攜帶NdeⅠ酶切位點(diǎn)的HA-pprM基因全長(zhǎng)，大小約438bp，經(jīng)NdeⅠ酶切后，與pRADK載體連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌，經(jīng)培養(yǎng)、質(zhì)粒提取純化后，以瓊脂糖凝

3、膠電泳、酶切鑒定以及基因測(cè)序確認(rèn)插入序列的正確性；將構(gòu)建好的重組質(zhì)粒pRADK-HA-pprM，以改良的CaC12法轉(zhuǎn)化到耐輻射奇球菌 pprM基因缺失菌株中，以表達(dá) HA-PprM融合蛋白，并用Western blot驗(yàn)證HA-PprM融合蛋白的表達(dá)。然后使用HA-tag抗體順利實(shí)施染色質(zhì)免疫沉淀技術(shù)（ChIP）獲得與PprM蛋白質(zhì)具有相互作用的DNA混合液，分別設(shè)計(jì)4個(gè)關(guān)鍵基因的啟動(dòng)子區(qū)域的PCR引物，ChIP PCR的方法檢測(cè) D

4、NA混合液相應(yīng)的啟動(dòng)子區(qū)域的結(jié)合情況。
　　結(jié)果：成功構(gòu)建pRADK-HA-pprM穿梭表達(dá)載體，經(jīng)測(cè)序分析，序列無(wú)任何突變；成功轉(zhuǎn)化到耐輻射奇球菌pprM基因缺失菌株中，并通過(guò)Western blot驗(yàn)證回補(bǔ)株中能夠表達(dá)HA-PprM融合蛋白；染色質(zhì)免疫沉淀（ChIP）與ChIP PCR實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示成功篩選到3個(gè)與PprM蛋白具有相互作用的靶DNA，分別是pprI、pprA、recA的啟動(dòng)子。
　　結(jié)論：1.成功構(gòu)建了 p

5、RADK-HA-pprM穿梭表達(dá)載體，并獲得耐輻射奇球菌pprM基因缺失回補(bǔ)菌株；2.應(yīng)用ChIP PCR技術(shù)發(fā)現(xiàn)2 kGy輻照及未輻照條件下耐輻射奇球菌PprM蛋白均不與自身基因啟動(dòng)子結(jié)合；未輻照條件下PprM蛋白不與pprI、recA基因啟動(dòng)子結(jié)合而與pprA基因啟動(dòng)子結(jié)合；2 kGy輻照條件下PprM蛋白與pprI、recA、pprA三基因啟動(dòng)子均結(jié)合，且與pprA基因啟動(dòng)子結(jié)合能力增強(qiáng)。提示PprM蛋白可能作為一種輻射應(yīng)激轉(zhuǎn)錄因