ITP患者細胞毒和巨核細胞異常對血小板的影響及機制探討.pdf

1、特發(fā)性血小板減少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura ITP）是臨床最為常見的出血性、自身免疫性疾病，約占出血性疾病總數(shù)的30％。以外周血小板減少、骨髓巨核細胞正?；蛟龆喟槌墒煺系K為主要表現(xiàn)。目前，治療以長期使用腎上腺皮質(zhì)激素、免疫抑制劑及脾切除等方法為主，容易引發(fā)感染、骨髓抑制等，并且約有1/3的患者上述治療無效，遷延不愈，甚至危及生命。 本病發(fā)病機制復雜，至今尚未完全闡明。長期以來由

2、自身抗體介導的血小板破壞增多被看成是ITP的主要病因。即血小板膜表面糖蛋白（glycoprotein，GP）作為自身抗原，特別是GPⅡb/Ⅲa和GPⅠb/Ⅸ復合物，刺激機體免疫系統(tǒng)產(chǎn)生特異性自身抗體，通過其Fab段與自身抗原結合，致敏的血小板容易被機體的網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)所清除，特別是脾臟中的單核吞噬細胞吞噬破壞，從而導致血小板減少。 但是ITP發(fā)病具有明顯的異質(zhì)性。隨著研究的深入，體液免疫異常在ITP發(fā)病過程中起決定性作用的觀點已日

3、益受到挑戰(zhàn)。由于血小板自身抗體只能在50％-70％ITP患者中檢測到，并且陰性結果不能排除診斷。多數(shù)研究認為ITP患者呈Th1優(yōu)勢反應模式，而Th1優(yōu)勢反應除可促進抗體產(chǎn)生外，還能直接促進淋巴細胞的細胞毒作用。因此，近年來細胞免疫功能失調(diào)在ITP發(fā)病中的作用越來越受重視。研究發(fā)現(xiàn)ITP患者外周血CD8+細胞增多，CD4+/CD8+下降。Olsson等應用基因芯片技術發(fā)現(xiàn)在ITP患者與細胞毒作用有關的基因以及與Th1細胞反應有關的基因表達

4、增高，提示細胞介導的細胞毒作用可能在ITP發(fā)病中起重要作用。隨后，Olsson等和張峰等的體外實驗證實細胞毒性T淋巴細胞（cytotoxic T lymphocyte，CTL，CD8+T）能直接參與對ITP患者血小板的殺傷，導致血小板持續(xù)破壞。 目前普遍認為，除血小板破壞增多外，血小板生成減少也參與ITP的發(fā)病。血小板動力學研究及骨髓巨核細胞形態(tài)學檢查均證實ITP患者的血小板生成減少。既然巨核細胞表面亦表達GPⅡb/Ⅲa和GPⅠ

5、b/Ⅸ，血小板自身抗體同樣可以作用于巨核細胞，影響巨核細胞生成或導致巨核細胞在骨髓內(nèi)被活化的補體或吞噬細胞破壞。多項研究證實，純化的血小板膜糖蛋白抗體能夠抑制巨核細胞集落的增殖，進而影響血小板生成。Chang等和McMillan等發(fā)現(xiàn)ITP患者血漿和純化的血小板自身抗體可抑制體外巨核細胞生長，導致巨核細胞數(shù)量明顯降低。充分證明血小板特異性抗原的自身抗體不僅介導外周血小板破壞，還影響骨髓中巨核細胞的生長和發(fā)育成熟。但是多數(shù)ITP患者骨髓中

6、巨核細胞數(shù)量正常或增多，其血小板生成減少不能用巨核細胞數(shù)量降低解釋。 血小板生成與成熟巨核細胞的凋亡密切相關，巨核細胞凋亡異常即會引起血小板生成障礙。對ITP患者骨髓巨核細胞超微結構的研究表明，患者的巨核細胞存在廣泛的異常，這些異常的巨核細胞發(fā)生與凋亡相似但不同于凋亡的程序性細胞死亡，是導致血小板生成減少的重要原因。 我們首先應用改良MAIPA技術檢測ITP患者血漿中的特異性血小板膜糖蛋白（GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ）

7、自身抗體水平，以雙色流式細胞技術為基礎的細胞毒實驗技術檢測ITP患者及正常對照CTL對自身血小板的殺傷效應，比較MAIPA陽性和陰性ITP患者CTL對自體血小板的殺傷及地塞米松的作用。我們還將ITP患者血漿及其組分與正常臍血CD34+細胞共同孵育，定向擴增巨核細胞，觀察ITP血漿及其組分對巨核細胞和血小板形成的影響。 第一部分細胞毒作用在ITP發(fā)病及地塞米松治療中的意義研究 目的： 比較MAIPA陽性和陰性ITP

8、患者細胞毒T淋巴細胞對自體血小板的殺傷及地塞米松的作用，分析自身細胞毒殺傷血小板與抗血小板自身抗體的關系。 方法： *抽取48例ITP患者和17例正常人的外周血15ml，其中患者標本分別在大劑量地塞米松治療前和治療后兩周采樣。 *改良MAIPA檢測ITP患者血漿中抗GPⅡb/Ⅲa、GPⅠb/Ⅸ自身抗體。 *從外周血中分離單個核細胞和血小板。 *用免疫磁珠分離技術分離CD8+細胞。 *以自身

9、血小板為靶細胞，以CD8+細胞為效應細胞的細胞毒實驗。 *用CD41a和AnnexinⅤ標記血小板，流式細胞儀分析被AnnexinⅤ標記的血小板比例（血小板裂解率），以間接反映效應細胞的殺傷能力。 *在ITP患者MAIPA陽性組與陰性組間進行細胞毒作用的比較。 結論： *證實了細胞介導的細胞毒作用參與了ITP患者血小板破壞，而且在檢測不到抗GPⅡb/Ⅲa、Ⅰb/Ⅸ抗體的ITP患者發(fā)病中發(fā)揮更大作用。

10、 *地塞米松可能有抑制CTL介導的細胞毒殺傷血小板作用。保護自身血小板免受細胞介導的細胞毒作用是HD-DXM發(fā)揮治療作用的機制之一。 *干預CTL介導的血小板破壞可能成為ITP治療的一個新靶點 第二部分 ITP患者血漿對體外巨核細胞和血小板形成的影響及機制探討 目的： 研究ITP血漿及其組分對正常臍血CD34+細胞定向擴增巨核細胞和血小板形成的影響。 方法： *留取49例ITP患者和22

11、例正常人的外周血血漿。 *用免疫磁珠分離技術分離臍血CD34+細胞。 *親和層析法提取ITP患者和正常對照血漿IgG。 * ITP患者血漿的自身抗體吸附。 * CD34+細胞與ITP患者或正常對照血漿、IgG、自身抗體吸附后血漿共同孵育，定向擴增巨核細胞。 *流式細胞儀檢測CD41a的表達。 *檢測培養(yǎng)體系中生成的血小板。 * CD41a+細胞DNA倍體分析。 * CD41