前扣帶皮層吻側神經(jīng)元NR2B受體介導骨癌痛大鼠痛敏及痛厭惡情緒體驗的研究.pdf

1、研究背景：
　　隨著人們對NR2B研究的深入，由于NR2B局限于中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)分布，使得研究者更期待能夠研制出作用于NR2B的藥物，從而更精細，更準確的作用調節(jié)靶點，參痛厭惡情緒的調節(jié)與處理，并能減少使用非選擇性NMDA受體拮抗劑帶來如幻覺、煩躁不安等副作用。近年來大量的研究轉向這一方向:龍膽苦苷不僅能有效的抑制炎癥相關的異常性疼痛，而且減少了ACC的NR2B的表達，說明龍膽苦苷的鎮(zhèn)痛作用與ACC應對周圍傷害性刺激引起的谷氨酸能的

2、突觸傳遞密切相關。研究發(fā)現(xiàn)，選擇性的NR2B受體拮抗劑ifenprodil可以高效選擇性作用于NR2B受體，抑制NR2B亞基的表達，減輕背根神經(jīng)節(jié)壓縮性損傷引起的傷害性疼痛。Ifenprodil結合于NR2B亞基N末端發(fā)揮作用，已經(jīng)被用于評估NR2B受體在大腦功能和疾病方面的作用，可望用于治療疼痛、心境障礙和神經(jīng)變性等疾病。
　　小干擾RNA技術是采用從基因遺傳學研究的角度出發(fā)，運用重組慢病毒載體干擾，下調或沉默靶基因的技術，具有

3、高效、特異、穩(wěn)定、周期短及操作簡單等優(yōu)勢。Tan等利用鞘內(nèi)注射siRNA技術，下調NR2B基因的表達，從而有效抑制福爾馬林刺激引起的傷害性痛厭惡情緒體驗。
　　本研究擬首先構建NR2B/RNAi重組慢病毒表達載體，然后在大鼠腦立體定位儀的引導下將該重組慢病毒載體注入脛骨骨癌痛大鼠的rACC腦區(qū)，通過沉默骨癌痛大鼠rACC腦區(qū)神經(jīng)元NMDA受體2B亞基的表達，觀察NR2B/RNAi對癌痛慢性痛伴隨的痛不良情緒體驗的影響，期望為臨床癌

4、痛等慢性痛患者的不良情緒的治療提供動物學基礎研究的支持。
　　研究方法與結果：
　　1、rACC腦區(qū)注射選擇性的NR2B受體阻斷劑Ifenprodil對骨癌痛大鼠伴隨痛厭惡情緒體驗的影響
　　方法：按照隨機數(shù)字表法隨機選取無位置偏愛的雄性Wistar大鼠30只隨機分為空白對照組(n=10)和骨癌痛組(n=20)，骨癌痛組大鼠右脛骨骨髓腔接種MADB-106細胞3μl（4.8×109個/ml），而空白對照組給予同等劑量的

5、生理鹽水作對照。骨癌痛組大鼠根據(jù)是否給予NR2B受體拮抗劑Ifenprodil治療進一步分為治療組(n=10)及非治療組(n=10)，術后第14天即條件性位置回避訓練前10min，治療組大鼠rACC內(nèi)注射NR2B受體阻斷劑Ifenprodill.2μl(0.2g/L)，而非治療組大鼠給予同等劑量的生理鹽水作為對照。采用VonFrey機械刺激法測量大鼠右后爪機械刺激痛閾的變化。采用機械刺激誘導觸誘發(fā)痛和條件性位置回避實驗測定骨癌痛大鼠伴隨

6、的痛厭惡情緒體驗（實驗裝置由A和B兩室組成，大鼠處于A室時機械刺激術側后爪誘發(fā)觸痛，而處于B室刺激對側作為對照。計算30min內(nèi)大鼠在A室所占時間的百分比以反映痛厭惡情緒）。
　　結果：接種MADB-106細胞第10天骨癌痛組大鼠術側后爪痛閾值明顯降低(P＜0.05)，術后第12天和第14天一直處于較低水平，而空白對照組術側后爪機械痛閾無顯著改變。組間比較術后第10、12和14天骨癌痛組明顯低于空白對照組(P＜0.05)。條件性位

7、置回避訓練實驗中，非治療組大鼠在A室滯留時間的百分比為(30±4)％，低于C組(52±5)％(P＜0.05);治療組大鼠在A室滯留時間的百分比為(42±5)％，較非治療組升高，但仍低于空白對照組(P＜0.05)。
　　2、rACC腦區(qū)注射NR2B/shRNA重組慢病毒對骨癌痛誘導的痛厭惡情緒體驗的沉默效應
　　方法：按照隨機數(shù)字表法選取正常雄性Wistar大鼠45只，隨機分為生理鹽水空白對照組（NS組）、NR2B/RNAi干

8、擾慢病毒組（LV-NR2B組）和pGC-FU/RNAi組(LV-NC組)。首先向各組大鼠右脛骨骨髓腔接種MADB-106細胞3μl(4.8×109個/ml)制備骨癌痛模型，然后在大鼠腦立體定位儀引導下向LV-NR2B組大鼠rACC注射NR2B/siRNA重組慢病毒(0.2μl，109TU/ml)，注藥后再注入2μl的生理鹽水，以保證藥物在rACC腦區(qū)內(nèi)。而LV-NC組和NS組大鼠分別注入相同容量的pGC-FU/RNAi陰性重組慢病毒和生

9、理鹽水，其余操作同LV-NR2B組。不同時間點采用Von Frey機械刺激法測量大鼠右后爪機械刺激痛閾的變化。采用機械刺激誘導觸誘發(fā)痛和條件性位置回避實驗測定骨癌痛大鼠伴隨的痛厭惡情緒體驗（實驗裝置由A和B兩室組成，大鼠處于A室時機械刺激術側后爪誘發(fā)觸痛，而處于B室刺激對側作為對照。計算30min內(nèi)大鼠在A室所占時間的百分比以反映痛厭惡情緒體驗）。行為學實驗結束后，處死各組大鼠，取ACC組織分別用RT-PCR、Western Blott

10、ing法和免疫熒光技術檢測NR2BmRNA和NR2B蛋白的表達情況。
　　結果：接種MADB-106細胞第7天LV-NC組和NS組大鼠術側后爪痛閾值開始降低，術后第14天和第21天一直處于較低水平(P＜0.05);組間比較術后第14和21天LV-NC組和NS組大鼠機械刺激痛閾值明顯低于LV-NR2B組(P＜0.05)。條件性位置回避訓練實驗中，LV-NR2B組大鼠在A室滯留時間的百分比為(46.46±1.31)％，較LV-NC組大

11、鼠(32.11±2.23)％和NS組大鼠(31.89±1.43)％升高(P＜0.05)。RT-PCR結果顯示，LV-NC組NR2B基因mRNA表達與NS組比較無顯著差異，LV-NR2B組大鼠NR2B基因mRNA表達較LV-NC組和NS組均明顯下降(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。Western blot結果顯示，LV-NR2B組NR2B蛋白的表達明顯低于LV-NC組和NS組(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義，而LV-NC組和NS組大鼠

12、NR2B蛋白的表達無明顯差異。隨機拍取的免疫熒光圖片顯示，LV-NR2B組熒光表達較LV-NC組和NS組明顯減少(P＜0.05)，差異有統(tǒng)計學意義。
　　研究總結：
　　前扣帶回皮層吻側部注射高選擇性的NR2B受體阻斷劑ifenprodil能夠減輕骨癌痛大鼠伴隨的痛厭惡情緒體驗。同時，采用NR2BsiRNA技術沉默rACC區(qū)NR2B亞基的表達有效地減弱了骨癌痛伴隨的痛厭惡情緒。本研究可為骨癌痛伴隨痛厭惡情緒的臨床治療和相關研