單倍體相合細(xì)胞移植治療小鼠H22實(shí)體瘤的實(shí)驗(yàn)研究.pdf

1、免疫治療是惡性腫瘤的重要治療手段之一。由于在異基因造血干細(xì)胞移植(Allo-HSCT)中觀察到移植物抗白血病(GVL)效應(yīng)的存在，并發(fā)現(xiàn)移植后進(jìn)行供者淋巴細(xì)胞輸注(DLI)可以增加抗腫瘤效應(yīng)，人們開始對(duì)這種現(xiàn)象進(jìn)行研究。目前，異基因造血干細(xì)胞移植不僅是一種提高化療劑量的載體，而且已被作為一種腫瘤免疫治療的手段。但這種治療手段具有較高的治療風(fēng)險(xiǎn)和存在供者來源不足的問題，雖然非清髓造血干細(xì)胞移植(NST)的開展在一定程度上降低了治療的風(fēng)險(xiǎn)，

2、主要組織相容抗原復(fù)合物(MHC)不全相合移植的發(fā)展解決了供者來源不足的問題，但移植相關(guān)并發(fā)癥和移植相關(guān)死亡率(TRM)仍是限制其實(shí)際應(yīng)用的主要障礙。如何保留移植物抗腫瘤(GVT)效應(yīng)而降低TRM、擴(kuò)大異基因免疫治療的實(shí)際(特別是在實(shí)體瘤方面)應(yīng)用范圍，是臨床的一大課題。 在本研究中，我們通過動(dòng)物實(shí)驗(yàn)，對(duì)單倍體相合細(xì)胞移植誘發(fā)GVT效應(yīng)進(jìn)行觀察，并對(duì)如何減輕GVHD以及GVT的效應(yīng)機(jī)制進(jìn)行初步的探索。 第一部分：可供單倍體

3、相合移植研究的實(shí)體瘤動(dòng)物模型的建立。實(shí)驗(yàn)共進(jìn)行三次，每次6只F1小鼠。方法：將BABL／C來源的H22肝癌細(xì)胞接種于BALB／CxC57BL／6雜交n代小鼠皮下，通過觀察接種H22細(xì)胞后n小鼠腫瘤的形成、生長過程，測量腫瘤大小并計(jì)算腫瘤體積的變異系數(shù)，探索H22細(xì)胞在n小鼠的成瘤性；以流式細(xì)胞儀檢測H22細(xì)胞的MHC表型；對(duì)實(shí)體瘤組織進(jìn)行病理學(xué)觀察。結(jié)果：每只F1小鼠右腋皮下接種2×106個(gè)H22細(xì)胞5、6天后，腫瘤開始長出，成瘤率為1

4、00％，腫瘤生長速度尚均勻，接種第14天時(shí)，三次實(shí)驗(yàn)的腫瘤體積變異系數(shù)分別為23％、34％、27％，腫瘤無自發(fā)緩解，全部小鼠死于腫瘤。H22細(xì)胞的H-2Ka表達(dá)率為75．70％士9．32％。病理學(xué)檢查證實(shí)小鼠的皮下腫瘤組織為低分化癌。 第二部分：單倍體相合脾+骨髓細(xì)胞移植治療小鼠H22實(shí)體瘤的作用。方法：以皮下接種H22細(xì)胞的BABL／C×C57BL／6雜交n代雌性小鼠為受者，以健康雌性Fl、雄性C57BL／6、雄性C3H小鼠為

5、MHC全相合、單倍體相合、不相合供者，根據(jù)受者是否經(jīng)環(huán)磷酰胺(CTX)腹腔化療預(yù)處理和供者細(xì)胞的不同，分為：A組無化療無移植、B組無化療單移植(經(jīng)7．5GyC~Co照射的單倍體相合細(xì)胞)、C組單化療無移植(對(duì)照組)、D組化療+全相合、E組化療+不相合、F組化療+無照射單倍體相合、G組化療+經(jīng)照射單倍體相合，比較移植后各組小鼠的腫瘤大小和抑瘤率；觀察供者細(xì)胞經(jīng)7．5Gy60。照射的單倍體相合移植對(duì)外周血白細(xì)胞、肝腎功能和嵌合體形成的影響；

6、比較供者細(xì)胞經(jīng)與不經(jīng)60Co照射的單倍體相合移植的GVHD程度。結(jié)果：未經(jīng)化療預(yù)處理、只輸注經(jīng)60C0照射的單倍體相合細(xì)胞的小鼠(B組)，沒有出現(xiàn)抗腫瘤效應(yīng)，與空白組(無化療無移植，A組)一樣，腫瘤生長快于經(jīng)化療預(yù)處理的C．G組小鼠；在經(jīng)化療預(yù)處理的小鼠中(C—G組)，F(xiàn)、G組小鼠的腫瘤生長最慢，移植后第18天時(shí)腫瘤重量明顯小于對(duì)照組(C組)，差異具有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0．05)；而F組和G組小鼠腫瘤重量的差異沒有顯著的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(

7、P>0．05)。骨髓細(xì)胞Y染色體PCR法檢測結(jié)果提示：B組小鼠骨髓里沒有檢測到Y(jié)染色體的表達(dá)；脾細(xì)胞MHC表型變化過程的流式細(xì)胞術(shù)檢測和骨髓細(xì)胞Y染色體PCR法檢測結(jié)果提示：小鼠經(jīng)化療預(yù)處理，輸注經(jīng)60Co照射的單倍體相合供者細(xì)胞，可以產(chǎn)生嵌合體。以上結(jié)果提示單倍體相合細(xì)胞移植可以誘導(dǎo)抗腫瘤效應(yīng)，抗腫瘤效應(yīng)的出現(xiàn)與單倍體相合的細(xì)胞移植植活有關(guān)，因此是GVT效應(yīng)。在GVHD方面，除后期使小鼠體重有所下降外，G組小鼠沒有其它GVHD的臨床表

8、現(xiàn)，病理切片顯示其GVHD的程度較供者細(xì)胞不經(jīng)照射的移植組(F組)明顯要輕，提示供者細(xì)胞經(jīng)7．5Gy60Co照射的單倍體相合細(xì)胞移植，可以在減輕GVHD的情況下保留GVT。同時(shí)，供者細(xì)胞經(jīng)60C0照射的單倍體相合細(xì)胞移植對(duì)小鼠的外周血白細(xì)胞(WBC)、肝腎功能沒有明顯的不良影響。 第三部分：探討NKG2D及其配體RAE-1、H60在單倍體相合細(xì)胞移植介導(dǎo)的移植物抗腫瘤效應(yīng)中的作用。以皮下接種H22細(xì)胞的BABL／C×C57BL／

9、6雜交n代(CB6F1)小鼠為受者，以C57BL／6小鼠的骨髓+脾細(xì)胞為供者細(xì)胞，供者細(xì)胞分別用純化的抗CD90．2、NKl．1和NKG2D單克隆抗體去除T細(xì)胞、NK細(xì)胞和封閉NKG2D受體后經(jīng)7．5GyCOCo照射，進(jìn)行不同成份單倍體相合細(xì)胞移植，觀察移植后的抗腫瘤效應(yīng)。以半定量RT-PCR法檢測單倍體相合細(xì)胞移植后第3、7、14、18天小鼠腫瘤組織RAE-1、H60的mRNA表達(dá)水平。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：去除供者T細(xì)胞、NK細(xì)胞和封閉NKG2

10、D的單倍體相合移植均導(dǎo)致GVT效應(yīng)的下降，移植18天后，小鼠腫瘤的重量與對(duì)照組(單純預(yù)處理沒有細(xì)胞移植)比，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0．05)。去除供者T細(xì)胞和NK細(xì)胞移植的抑瘤率分別為16．9％、44．6％，封閉NKG2D受體的移植則失去抑瘤作用，提示供者T細(xì)胞、NK細(xì)胞和NKG2D受體在殺傷腫瘤的效應(yīng)中起重要作用，其中T細(xì)胞是最主要的效應(yīng)細(xì)胞，NKG2D受體是活化T細(xì)胞、NK細(xì)胞等效應(yīng)細(xì)胞的重要因素。單倍體相合細(xì)胞移植后小鼠腫瘤細(xì)胞