異育銀鯽粘孢子蟲(chóng)PCR檢測(cè)方法的建立與初步應(yīng)用.pdf

1、異育銀鯽是我國(guó)重要的鯽魚(yú)養(yǎng)殖品種，隨著養(yǎng)殖規(guī)模的不斷擴(kuò)大，各類病害接踵而至，病害問(wèn)題已成為制約異育銀鯽產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的瓶頸因素，尤其是粘孢子蟲(chóng)病，嚴(yán)重威脅著異育銀鯽的苗種培育和成魚(yú)養(yǎng)殖。其中，武漢單極蟲(chóng)、洪湖碘泡蟲(chóng)、吳李碘泡蟲(chóng)及丑陋圓形碘泡蟲(chóng)對(duì)異育銀鯽的危害最為嚴(yán)重，不僅影響宿主的生長(zhǎng)發(fā)育，使商品魚(yú)失去應(yīng)有的經(jīng)濟(jì)價(jià)值，嚴(yán)重時(shí)甚至引起感染魚(yú)的大量死亡。為有效控制粘孢子蟲(chóng)病害，亟需建立異育銀鯽重要寄生粘孢子蟲(chóng)的快速、準(zhǔn)確、實(shí)用的檢測(cè)方法。因此

2、，本研究以這4種粘孢子蟲(chóng)為研究對(duì)象，建立單輪PCR與多重PCR檢測(cè)方法，以期為粘孢子蟲(chóng)病的快速診斷與防治提供技術(shù)支持。
　　1.4種粘孢子蟲(chóng)單輪PCR檢測(cè)方法的建立:分別以武漢單極蟲(chóng)的28S rDNA、洪湖碘泡蟲(chóng)與吳李碘泡蟲(chóng)的ITS-5.8S rDNA、丑陋圓形碘泡蟲(chóng)的18S rDNA基因?yàn)榉肿影袠?biāo)，各篩選一對(duì)特異性引物，特異性產(chǎn)物大小依次為245bp、447bp、590bp、894bp。試驗(yàn)證明4對(duì)引物的特異性與通用性良好，無(wú)非

3、特異性擴(kuò)增干擾，對(duì)非目的粘孢子蟲(chóng)無(wú)交叉反應(yīng)。靈敏性試驗(yàn)結(jié)果顯示，四種單輪PCR方法的檢測(cè)靈敏性均達(dá)到了Pg級(jí)水平。
　　2.4種粘孢子蟲(chóng)多重PCR檢測(cè)方法的建立:在上述建立的單輪PCR基礎(chǔ)上，將4對(duì)引物置于同一個(gè)PCR體系，通過(guò)反應(yīng)體系與條件的優(yōu)化，成功在同一個(gè)反應(yīng)體系中擴(kuò)增出4條目的條帶，且能明顯區(qū)分，無(wú)非特異性擴(kuò)增干擾。靈敏性試驗(yàn)顯示，建立的多重PCR方法對(duì)四種粘孢子蟲(chóng)的檢測(cè)靈敏性均達(dá)到了ng級(jí)水平。
　　3.兩種PCR