雞糞中多重耐藥細菌的分離鑒定及介導抗性基因水平轉(zhuǎn)移元件的檢測.pdf

1、由于抗生素在禽畜養(yǎng)殖、臨床醫(yī)藥等方面的大量使用，近年來出現(xiàn)了大量的多重耐藥細菌，但是，多重耐藥菌產(chǎn)生的機制并不完全清楚。研究表明，質(zhì)粒經(jīng)常攜帶一些可移動的元件（如轉(zhuǎn)座子），捕捉不同的抗性基因介導抗生素抗性基因的擴散，這被認為是多重耐藥細菌產(chǎn)生的主要機制之一。本論文圍繞質(zhì)粒在環(huán)境抗生素抗性基因水平傳播中所起的作用進行以下幾方面的研究:
　　一、雞糞中多重耐藥細菌的分離鑒定及抗性檢測。用含有慶大霉素、氯霉素、阿莫西林、頭孢氨芐、環(huán)丙沙

2、星、四環(huán)素、紅霉素、卡那霉素這八種抗生素的培養(yǎng)基(LB培養(yǎng)基、SS培養(yǎng)基)，我們從一規(guī)?；B(yǎng)雞場的雞糞中篩選出35株多重耐藥細菌。這些多重耐藥細菌分布在13個不同的屬，以革蘭氏陰性細菌為主導。在LB培養(yǎng)基中G-細菌與G+細菌分別占63％和37％，在SS培養(yǎng)基中G-細菌與G+細菌分別占87％和13％。這些細菌中對紅霉素具有耐藥性的最多，對阿莫西林具有耐藥性的最少，它們分布于變形菌門、放線菌門以及厚壁菌門?？股乜剐曰虺Ｅc重金屬抗性基因定

3、位在同一個遺傳元件上，我們將沒有抗生素抗性的大腸桿菌與2株耐8種抗生素細菌進行對比實驗。結果表明，這些多重耐藥菌對Zn、Pb、Cu、Mn的抗性比沒有抗生素抗性的細菌強。
　　二、多重耐藥細菌質(zhì)粒的檢測及遺傳特性研究。我們提取了各多抗菌的抗性質(zhì)粒并轉(zhuǎn)化入模式菌株DH5a中。進一步檢測發(fā)現(xiàn)，這些多抗菌中均有一大小在15kb左右的質(zhì)粒被成功轉(zhuǎn)入DH5a中。攜帶該質(zhì)粒的DH5a可以在加有四環(huán)素、卡那霉素、頭孢氨芐的LB固體培養(yǎng)基上生長，這

4、表明該質(zhì)粒上可能攜帶這三種抗生素抗性基因。測序結果顯示，該質(zhì)粒大小為14591bp，將其與NCBI中現(xiàn)有質(zhì)粒進行同源性對比分析，發(fā)現(xiàn)其與一植物雙元穿梭表達載體pZGA22的相似度達到99％。通過生物信息學分析，我們發(fā)現(xiàn)其攜帶編碼四環(huán)素類（tetR_C、tetR_N）、磷酸轉(zhuǎn)移酶類(NTPⅡ、NTPⅢ)抗性基因以及一個能同時控制多種抗生素抗性和重金屬抗性的超家族域Glo_EDI_BRP。這些結果表明，該質(zhì)粒很可能具有介導環(huán)境中多種耐藥基因

5、（包括多種重金屬抗性基因）發(fā)生水平轉(zhuǎn)移的能力。
　　三、質(zhì)粒的水平轉(zhuǎn)移情況研究。首先，我們對不同多抗菌中15Kb大小質(zhì)粒進行膠回收后酶切。酶切后的電泳圖譜顯示，這些質(zhì)粒很可能是同一個質(zhì)粒。接下來，我們根據(jù)該質(zhì)粒的全序列設計12對引物，對其進行PCR擴增測序與拼接。結果顯示，存在于干燥棒狀桿菌Corynebacterium xerosis、河流漫游球菌Vagococcus fluvialis、大腸桿菌Escherichia coli