限制性吸煙人群尿液中丙烯腈代謝物——巰基尿酸的研究.pdf

1、煙氣中丙烯腈具有較強(qiáng)的神經(jīng)毒性與潛在的致癌性，會(huì)增加接觸人群的健康風(fēng)險(xiǎn)，因此對(duì)其接觸人群進(jìn)行生物監(jiān)測(cè)具有較為重要的意義。丙烯腈的兩種巰基尿酸代謝物N-乙?；?S-（2-腈基乙基）-L-半胱氨酸（CEMA）和N-乙酰基-S-（2-羥基乙基）-L-半胱氨酸（HEMA）與其接觸具有一定劑量效應(yīng)關(guān)系，可以作為潛在的生物標(biāo)志物。本研究旨在選擇合適的前處理方式（直接稀釋進(jìn)樣和在線的柱轉(zhuǎn)換），建立LC-MS/MS 同時(shí)測(cè)定尿液中CEMA和HEMA 方

2、法；通過一個(gè)限制性吸煙方案的實(shí)施，獲得非吸煙人群和限制性吸煙人群尿液中CEMA和HEMA的含量水平；分析吸煙對(duì)尿液CEMA和HEMA 含量的影響及其與煙堿代謝物可替寧的相關(guān)性，評(píng)價(jià)CEMA和HEMA的煙氣特異性；揭示尿液中CEMA和HEMA與煙氣丙烯腈的關(guān)系；為研究吸煙人群煙氣丙烯腈接觸風(fēng)險(xiǎn)提供有力證據(jù)，為綜合評(píng)價(jià)吸煙致癌性提供理論依據(jù)。
　　 （1）建立了尿液中CEMA和HEMA的RRLC-MS/MS分析方法。稀釋后的尿液樣本

3、經(jīng)過簡單的過濾后直接引入快速高分辨液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（RRLC-MS/MS），在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)模式下進(jìn)行定量分析。樣品的分離是在Agilent Zorbax Eclipse Plus C18 (RRHT 2.1×50 mm，1.8 μm)色譜柱上實(shí)現(xiàn)，分析時(shí)間僅需要6 min。CEMA和HEMA的檢出限（LOD）達(dá)到0.01 ng/mL和0.05ng/mL。與其它的方法相比，此方法提供了更好的分離能力，降低了分析物的LOD，并提高了分析速度

4、，可以實(shí)現(xiàn)尿液中CEMA和HEMA的快速、高通量的分析。
　　 （2）改進(jìn)直接進(jìn)樣方法，利用限進(jìn)性色譜柱建立柱轉(zhuǎn)換LC-MS/MS 檢測(cè)尿液中CEMA和HEMA的方法。尿液基質(zhì)中的大分子蛋白和水溶性鹽類被流動(dòng)相洗脫出來，小分子的巰基尿酸類物質(zhì)在這個(gè)小柱上面得到了純化與富集，通過一個(gè)十通閥切換到分析柱分離，最后進(jìn)入串聯(lián)質(zhì)譜檢測(cè)。CEMA和HEMA的LOD分別是0.001和0.030ng/mL。平均的日內(nèi)、日間重復(fù)性范圍是2.4％-

5、3.8％和2.7％-10.5％。與文獻(xiàn)報(bào)道的離線LC-MS/MS 相比，此方法無需繁瑣的前處理過程，并且靈敏度高。與報(bào)道的柱轉(zhuǎn)換方法相比，此柱轉(zhuǎn)換-LC-MS/MS 方法儀器搭建過程更為簡單，能較好的純化尿液樣本，靈敏度高，適合于大量樣本CEMA和HEMA的檢測(cè)。
　　 （3）建立了LC-MS/MS 直接檢測(cè)稀釋尿液中肌酐的方法。24 小時(shí)尿肌酐清除率相對(duì)恒定，常用來校正尿液中分析物的濃度。本論文采用電噴霧離子源，三重四級(jí)桿質(zhì)譜

6、在多反應(yīng)監(jiān)測(cè)正離子模式下對(duì)離心稀釋的尿液樣本進(jìn)行定量分析。標(biāo)準(zhǔn)曲線的線性范圍是1-2000 ng/mL，LOD是0.3 ng/mL。日內(nèi)、日間重復(fù)性（CVs）都小于5％。此方法靈敏度高，選擇性強(qiáng)，且檢測(cè)數(shù)據(jù)與經(jīng)典的酶解分光光度法的檢測(cè)數(shù)據(jù)顯著相關(guān)。利用該方法測(cè)定的肌酐數(shù)據(jù)校正尿液中CEMA和HEMA的濃度，準(zhǔn)確性較好，消除了儀器差異帶來的誤差。
　　 建立了快速測(cè)定尿液中可替寧LC-MS-MS 方法?？商鎸幨菬焿A的主要代謝物之一

7、，由于其來源的唯一性與合適的生物半減期，是目前公認(rèn)的評(píng)價(jià)短期內(nèi)煙氣接觸水平的生物標(biāo)志物。該方法將尿液樣本通過稀釋過濾直接進(jìn)樣分析，選取一種小粒徑（3.5μm），窄柱徑（2.1 mm）的色譜柱來提高分離能力與選擇性。方法回收率94.3％-99.9％；其相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差為1.0％-3.2％，檢出限為0.08 ng/mL，線性范圍為（1-500）ng/mL。此方法簡單、快速、靈敏度高，適合吸煙和非吸煙者尿液中可替寧的檢測(cè)。
　　 （4）設(shè)

8、計(jì)了限制性吸煙實(shí)驗(yàn)方案，包括志愿者招募與篩選，限制性吸煙實(shí)驗(yàn)過程，大量樣本的分析與檢測(cè)及數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)分析。該方案采集62個(gè)非吸煙者的62個(gè)尿液樣本和86個(gè)吸煙者三次實(shí)驗(yàn)的258個(gè)24 小時(shí)尿液樣本。應(yīng)用本論文建立的方法分別測(cè)定樣品中CEMA和HEMA 含量、肌酐和可替寧的含量。結(jié)果表明：CEMA和HEMA在吸煙者尿液中的含量比非吸煙者分別高10 倍和3 倍多，吸煙對(duì)尿液中CEMA和HEMA含量水平有顯著影響 (P＜0.001)；吸煙者抽吸