液體深層發(fā)酵培養(yǎng)的樺褐孔菌三萜化合物的生物合成研究.pdf

1、樺褐孔菌(Inonotus obliquus)是一種非常珍稀的藥用真菌,研究表明其子實(shí)體和發(fā)酵菌絲體內(nèi)含有多種生物活性物質(zhì),具有廣泛的藥用開發(fā)價值。樺褐孔菌三萜化合物是樺褐孔菌中的一類重要的生物活性物質(zhì),它具有抗腫瘤、抗病毒、抗炎、提高免疫等活性。液體深層發(fā)酵技術(shù)作為現(xiàn)代生物工程的產(chǎn)物有著生產(chǎn)周期短,不受季節(jié)氣候限制,產(chǎn)物產(chǎn)量高和便于精確控制發(fā)酵參數(shù)等優(yōu)點(diǎn),非常適用于樺褐孔菌三萜化合物的生產(chǎn)。本文在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基上研究了樺褐孔菌液體深層

2、發(fā)酵產(chǎn)三萜化合物的動態(tài)特性。以發(fā)酵菌絲體內(nèi)三萜化合物總含量為指標(biāo),利用統(tǒng)計學(xué)的方法優(yōu)化了液體發(fā)酵培養(yǎng)基,通過從子實(shí)體分離得到的樺褐孔菌中4種具有代表性的三萜化合物,建立HPLC分析三萜化合物組成的方法。在此基礎(chǔ)上比較了優(yōu)化培養(yǎng)基和基礎(chǔ)培養(yǎng)基分別得到的菌絲體和子實(shí)體中的三萜化合物總含量和4種主要三萜化合物組成。茉莉酸甲酯(MeJA)作為一種植物信號分子,在植物組織培養(yǎng)中能夠誘導(dǎo)次級代謝產(chǎn)物的產(chǎn)生。論文中研究了發(fā)酵過程中不同濃度的MeJA和

3、不同助劑對三萜化合物產(chǎn)量的影響,以及不同發(fā)酵階段中MeJA對三萜化合物生物合成的作用,最終建立了一個較為完整的樺褐孔菌三萜類化合物液體深層發(fā)酵的體系,取得了較好的結(jié)果。
　　 1.對樺褐孔菌菌株(Inonotus obliquus CBS314.39)的原始菌種進(jìn)行活化純培養(yǎng),對Mea平板菌落、菌絲形態(tài)進(jìn)行初步的形態(tài)學(xué)研究。在發(fā)酵基礎(chǔ)培養(yǎng)基的基礎(chǔ)上考察了生物量,還原糖,pH,三萜化合物總含量等各項(xiàng)發(fā)酵參數(shù)的變化,確定發(fā)酵周期10

4、天。
　　 2.利用統(tǒng)計方法對樺褐孔菌液體發(fā)酵培養(yǎng)基進(jìn)行了優(yōu)化,確定了發(fā)酵產(chǎn)三萜化合物的最佳培養(yǎng)基。首先利用單因素試驗(yàn)確定了葡萄糖和混合氮源(蛋白胨+酵母粉)為最優(yōu)碳氮源,再用部分因子試驗(yàn)設(shè)計,篩選出了葡萄糖、蛋白胨、酵母粉及CaCl2對發(fā)酵菌絲體內(nèi)三萜生物合成有顯著性影響,最后用響應(yīng)面法對篩選出的主要因子進(jìn)行優(yōu)化,最后通過優(yōu)化得到培養(yǎng)基最佳組成為(g/L):葡萄糖58.9,蛋白胨2.9,CaCl20.5,酵母粉1.2,KH2P

5、O41.0,MgSO40.2。在此培養(yǎng)基條件下,菌絲體生物量達(dá)到為8.38 g/L,三萜化合物含量提高到57.1 mg/g,且相對優(yōu)化前三萜化合物含量41.8 mg/g提高了36.6％,比天然子實(shí)體中三萜化合物含量36.3 mg/g提高了57.3％。同時對三種條件下樺褐孔菌中4種主要三萜化合含量進(jìn)行了分析,結(jié)果顯示除羊毛甾醇外,發(fā)酵菌絲體的三萜含量均高于野生子實(shí)體,且優(yōu)化培養(yǎng)基中菌絲體內(nèi)4種三萜含量與基礎(chǔ)培養(yǎng)基的有顯著差異。優(yōu)化條件下四

6、種三萜化合物,栓菌酸、白樺脂醇、樺褐孔菌醇和羊毛甾醇的含量分別達(dá)到1.72 mg/g,3.23 mg/g,4.02 mg/g和0.50 mg/g。
　　 3.通過從子實(shí)體中分離得到了四種主要的三萜化合物,并通過結(jié)構(gòu)分析確定為栓菌酸、白樺脂醇、樺褐孔菌醇和羊毛甾醇,并以它們?yōu)闃?biāo)準(zhǔn)品建立了分析樺褐孔菌中四種三萜化合物組成準(zhǔn)確可靠的HPLC分析方法。
　　 4.重點(diǎn)研究了MeJA對樺褐孔菌中三萜化合物生物合成的影響,結(jié)果表明:

7、MeJA對三萜合成具有顯著的誘導(dǎo)作用,以吐溫-20為助劑時50μM的MeJA效果最好,三萜化合物含量達(dá)到最大值57.4 mg/g。且在不同發(fā)酵階段誘導(dǎo)三萜合成的效果不一樣,在發(fā)酵初期階段加入,對菌絲體生長具有明顯抑制作用,在發(fā)酵后期誘導(dǎo)三萜合成作用不明顯,在菌絲體對數(shù)生長期(第6天)MeJA誘導(dǎo)作用最顯著,三萜總含量達(dá)到了最大值63.1 mg/g,比對照組(第10天)41.2 mg/g提高了53.2％。但比較四種主要三萜化合物的含量變化