Vav1在吲哚胺2，3雙加氧酶抑制T淋巴細(xì)胞活性中的功能及機(jī)制探討.pdf

1、目的： 通過對(duì)Vav1與腫瘤浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞（tumor infltrating T lymphocytes，TIL-T）活性的研究，提出腫瘤誘導(dǎo)的T細(xì)胞失能的分子機(jī)制；初步探討TIL-T中Vav1基因的表達(dá)情況及其與腫瘤局部微環(huán)境中吲哚胺2，3雙加氧酶（indoleamine-2，3-dioxygenase，IDO）的表達(dá)的相關(guān)性，提出腫瘤誘導(dǎo)的T細(xì)胞失能的一個(gè)可能的分子機(jī)制；分析IDO對(duì)T細(xì)胞活性、Vav1基因和蛋白表達(dá)水平，

2、Vav1蛋白磷酸化及其下游信號(hào)分子[Ca2+]流、MAPK、NF-κB等的影響，同時(shí)測(cè)定IL-2基因的表達(dá)水平。提出TIL-T中Vav1信號(hào)異常的可能機(jī)制；提出調(diào)控TIL-T活性的方法，為糾正腫瘤誘導(dǎo)的免疫抑制提供新的解決方法。 內(nèi)容： 1）檢測(cè)TIL-T中Vav1 mRNA的表達(dá)水平，分析其與T細(xì)胞活性、腫瘤局部IDO表達(dá)水平的相關(guān)性。 2）體外以穩(wěn)定表達(dá)IDO的CHO細(xì)胞與T細(xì)胞共孵育，觀察IDO對(duì)T細(xì)胞增殖

3、、凋亡的影響，以及對(duì)Vav1基因、蛋白表達(dá)及Vav1蛋白活化的作用；觀察IDO對(duì)T細(xì)胞中Vav1下游信號(hào)主要傳導(dǎo)途徑[Ca2+]流、MAPK及NF-κB的變化。探討IDO在調(diào)控Vav1表達(dá)和活化中的作用，以及Vav1進(jìn)一步調(diào)節(jié)T細(xì)胞活性的機(jī)制。 3）將IDO抑制劑1-甲基色氨酸（1-MT）加入共孵育體系，觀察T細(xì)胞增殖、凋亡以及Vav1信號(hào)途徑的變化。 方法： 1）無菌條件下分離肺癌原位TIL-T及惡性胸腹水中的

4、T淋巴細(xì)胞，在體外加入刺激活化因子，觀察T淋巴細(xì)胞對(duì)刺激的反應(yīng)性，同時(shí)檢測(cè)T細(xì)胞中Vav1基因的表達(dá)水平；再用免疫組化的方法觀察肺癌原位腫瘤組織中IDO蛋白的表達(dá)情況。 2）體外以穩(wěn)定表達(dá)IDO的CHO細(xì)胞株與外周血正常T細(xì)胞共同培養(yǎng)，MTT法檢測(cè)T淋巴細(xì)胞的增殖率，流式細(xì)胞儀檢測(cè)T細(xì)胞凋亡，Real-time PCR法檢測(cè)Vav1和IL-2 mRNA水平，Western blot免疫印跡和免疫沉淀的方法檢測(cè)Vav1蛋白表達(dá)及磷

5、酸化水平，及其下游分子ERK1/2、p38和IκBα的活化；應(yīng)用細(xì)胞鈣離子成像系統(tǒng)檢測(cè)單細(xì)胞內(nèi)[Ca2+]i的動(dòng)態(tài)變化。 3）以IDO抑制劑1-MT加入共孵育體系，觀察T細(xì)胞增殖、凋亡以及Vav1基因蛋白表達(dá)水平和下游信號(hào)途徑的變化。 結(jié)果： 1）在11例肺癌患者腫瘤原位手術(shù)標(biāo)本中，3例TIL-T對(duì)活化刺激信號(hào)的反應(yīng)性低下，只表現(xiàn)為極微的增殖反應(yīng)；其余8例TIL-T對(duì)刺激信號(hào)的反應(yīng)正常，可正常增殖。同樣用刺激活化

6、信號(hào)在體外對(duì)10例癌癥患者癌性胸腹水中T淋巴細(xì)胞進(jìn)行激活，我們觀察到，所有病例所采集的T細(xì)胞均能正常增殖。 2）利用Real-time PCR的方法對(duì)肺癌原位TIL-T和癌性胸腹水中分離得到的T淋巴細(xì)胞中Vav1的mRNA含量進(jìn)行了檢測(cè)，結(jié)果顯示可分為兩組：對(duì)刺激信號(hào)反應(yīng)正常的8例肺癌原位TIL-T和癌性胸腹水中的T細(xì)胞中，Vav1 mRNA含量與正常對(duì)照差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。而3例表現(xiàn)為“失能”狀態(tài)的T細(xì)胞中Vav

7、1的mRNA水平卻非常低（P<0.05）。 3）免疫組化檢測(cè)顯示所觀察的肺癌患者標(biāo)本中IDO陽性表達(dá)率為27.3%，肺癌原位組織及轉(zhuǎn)移性淋巴結(jié)中IDO表達(dá)呈一致性。3例IDO表達(dá)陽性的肺癌組織，其中浸潤(rùn)T淋巴細(xì)胞中Vav1基因表達(dá)水平較對(duì)照組下降；8例IDO表達(dá)陰性的肺癌組織Vav1基因表達(dá)水平與對(duì)照組的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。IDO表達(dá)陽性的3例標(biāo)本中TIL-T對(duì)活化刺激信號(hào)的反應(yīng)性低下。 4）穩(wěn)定表達(dá)IDO

8、的CHO細(xì)胞株經(jīng)檢測(cè)穩(wěn)定表達(dá)IDO mRNA和蛋白，表達(dá)的IDO經(jīng)氨基酸檢測(cè)分析可分泌至細(xì)胞外并且發(fā)揮活性；將此細(xì)胞與T細(xì)胞共孵育后，T細(xì)胞增殖下降，凋亡增加；Vav1 mRNA及蛋白水平下降，磷酸化水平降低，而且Vav1下游分子的活化水平均降低；同時(shí)IL-2基因的表達(dá)下降。 5）1-MT加入共孵育體系后，T細(xì)胞增殖及凋亡均可部分恢復(fù)，Vav1 mRNA及蛋白水平也可部分恢復(fù)。 結(jié)論： 1）Vav1基因的表達(dá)與腫

9、瘤局部浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞的活性具有相關(guān)性，與腫瘤局部微環(huán)境中IDO的表達(dá)水平具有相關(guān)性。部分肺癌原位腫瘤局部浸潤(rùn)的T淋巴細(xì)胞呈現(xiàn)為功能抑制狀態(tài)，在這些“失能”細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Vav1的表達(dá)下降。免疫組化結(jié)果提示IDO可能是腫瘤局部微環(huán)境中影響T細(xì)胞中Vav1蛋白表達(dá)和活化的重要因素之一。 2）IDO抑制T細(xì)胞增殖，誘導(dǎo)T細(xì)胞凋亡。IDO對(duì)TCR信號(hào)傳導(dǎo)通路具有調(diào)節(jié)作用。IDO及其代謝產(chǎn)物可能通過抑制T細(xì)胞中信號(hào)傳導(dǎo)蛋白Vav1及

10、其下游分子的表達(dá)和活化而抑制T細(xì)胞功能。 3）Vav1的低表達(dá)和活化障礙，導(dǎo)致其下游分子的活化障礙，以致IL-2因子的合成和分泌減少，使T細(xì)胞增殖抑制。Vav1的下調(diào)與T細(xì)胞的凋亡是否有關(guān)仍需進(jìn)一步探索。 4）Vav1信號(hào)通路在IDO誘導(dǎo)的T細(xì)胞凋亡中的作用尚需進(jìn)一步探索。本研究為進(jìn)一步探討IDO在病理或生理情況下對(duì)T細(xì)胞的抑制作用提供了另一個(gè)研究方向，初步探索了調(diào)控腫瘤局部T淋巴細(xì)胞功能的方法，同時(shí)為抗腫瘤免疫治療方法