KIR受體基因在中國漢族人群中的分布及其在異基因無關(guān)造血干細(xì)胞移植中的作用.pdf

1、目的和意義：造血干細(xì)胞移植(Hematopoietic Stem Cell Transplantation.HSCT)是目前治療惡性血液病的最有效方法之一，供者和患者人類白細(xì)胞抗原系統(tǒng)(Human Leukocyte Antigen，HLA)相合與否被認(rèn)為是影響造血干細(xì)胞移植成敗的決定性因素。但是，即使是在HLA高分辨基因分型全相合的造血干細(xì)胞移植中，移植預(yù)后在受者間也存在著很大的差異。因此，近年來，除了HLA基因相合外，自然殺傷細(xì)胞(

2、Natural Killer，NK)受體系統(tǒng)日益受到關(guān)注。殺傷細(xì)胞免疫球蛋白樣受體(killer Ig-like receptor，KIR)是表達(dá)在NK細(xì)胞及部分T細(xì)胞表面的一類受體，在異基因造血干細(xì)胞移植中起著重要的作用。KIR基因的分布在不同人種不同個體間存在很大的差異，目前尚缺乏對中國漢族人群KIR基因分布規(guī)律的了解，因而，研究KIR基因遺傳學(xué)背景的差異對進(jìn)一步探討其對疾病的影響具有重要意義。KIR基因有兩種單體型：單體型A和單體

3、型B。單體型A存在唯一的活化型受體基因2DS4，其中只有2DS4*001(包括2DS4*0010101、*0010102、*0010103、*00102、*00103)編碼NK細(xì)胞表面有功能的受體，其他等位基因(如2DS4*003、*004、*006、*007、*008、*009)在第5外顯子有22個堿基的缺失，導(dǎo)致移框突變使其所編碼的蛋白缺失了跨膜區(qū)和胞內(nèi)區(qū)，從而無法錨定在細(xì)胞膜上，以功能尚不明確的游離蛋白的形式存在。但是，到目前為止

4、，國內(nèi)外尚無針對KIR2DS4基因與造血干細(xì)胞移植相關(guān)的研究。隨著對KIR受體識別和殺傷腫瘤細(xì)胞重要作用的不斷了解，人們逐漸認(rèn)識到供者KIR與受者HLA遺傳背景影響了HSCT預(yù)后，由抑制型KIR(inhibitory KIR receptors，iKIR)-HLA“錯配模式”引起的NK細(xì)胞異源反應(yīng)性在HSCT中促進(jìn)移植物植入以及增強(qiáng)移植物抗白血病效應(yīng)(graft-versus-leukemia，GVL)的作用，已經(jīng)成為國內(nèi)外學(xué)者研究的熱

5、點(diǎn)。同時，供者來源的活化型KIR受體(activating KIR receptors，aKIR)傳導(dǎo)的活化信號對NK細(xì)胞活性的調(diào)節(jié)可能起到在臨床治療中如何控制移植物抗宿主病(graft-versus-host disease，GVHD)和調(diào)節(jié)移植物抗白血病效應(yīng)的作用。
　　 方法：研究對象為150例中國漢族人，75對接受異基因造血干細(xì)胞移植的供者及受者，患者白血病分型為ALL29例、CML24例、AML19例、其他惡性血液病3

6、例。
　　 此項研究共分為三部分：(1)采用基因測序(Sequence-based typing，SBT)對HLA-A，-B，-C，-DRB1和-DQB1位點(diǎn)進(jìn)行高分辨分型；采用序列特異性引物聚合酶鏈反應(yīng)(PCR-sequence-specific primers PCR-SSP)進(jìn)行KIR基因分型，研究了KIR基因以及KIR單體型在中國漢族人群中的分布情況以及與其他人種進(jìn)行了比較，并且在此基礎(chǔ)上分析了供者KIR和受者HLA的配

7、受體關(guān)系。(2)建立了SBT結(jié)合TOPO TA克隆的方法對2DS4等位基因進(jìn)行全長測序，證實了2DS4完整型與缺失型等位基因的存在，研究KIR2DS4等位基因在中國人群中的分布，分析了中國人群KIR2DS4等位基因的分布特點(diǎn)并發(fā)現(xiàn)了三個新等位基因。(3)建立了供者KIR-受者HLA的配受體模式，分析了“缺失配體”模式對異基因HSCT預(yù)后的影響；采用實時定量PCR(Real-time PCR)，對30例存在“缺失配體”的移植動態(tài)隨訪了受者

8、體內(nèi)KIR2DL1、2DS1、3DL1和3DS1基因在移植后的mRNA表達(dá)；并結(jié)合臨床資料，分析KIR單體型對移植預(yù)后的影響，同時進(jìn)一步分析了其中35例供者為KIR單體型A純合的移植中供者來源2DS4等位基因與移植后急性GVHD發(fā)生的關(guān)系，并且從轉(zhuǎn)錄水平研究了KIR2DL1/3DL1基因與異基因HSCT預(yù)后的相關(guān)性。
　　 結(jié)果：(1)17種KIR基因均能夠被檢測出，比例從21.3％至100％不等，所有樣本都存在框架基因3DL3

9、、3DP1、2DL4和3DL2，除框架基因以外，2DL1和2DP1是在中國漢族人群中分布最廣的基因，而比例最低的是2DL2和2DS3；44.0％的個體KIR分型為A/A，56.0％的個體KIR分型為B/x。KIR基因與KIR單體型在中國漢族人群中的分布比例與日本人群相似，而與高加索人群和非洲裔美國人群存在較大差異。(2)分析供者抑制型KIR受體與受者HLA配體分子，75例移植中有53例供者存在KIR2DL1基因而受者沒有HLA-C2組位

10、點(diǎn)；2例供者存在KIR2DL12/L3基因而受者沒有HLA-C1組位點(diǎn)；24例供者存在KIR3DL1基因而受者沒有HLA-Bw4位點(diǎn)。(3)中國漢族人群在KIR基因及2DS4等位基因分布上具有其獨(dú)特性。150例樣本中139例(92.7％)存在KIR2DS4基因，對2DS4基因全長測序后發(fā)現(xiàn)4個2DS4等位基因：KIR2DS4*00101、*003、*004和*007；78.4％(109/139)的個體存在2DS4*00101；2DS4缺

11、失型(個體存在1個或缺失2DS4*00101基因)與完整型(個體存在兩個2DS4*00101基因)的存在比率為1：2。在150例個體中，66例KIR分型為A/A，84例KIR分型為B/x型。在A/A組中，42.4％(28/66)的個體為完整型/缺失型2DS4雜合，明顯高于B/x組(9.5％，8/84)；12.1％(8/66)的個體為缺失型2DS4純合，這個比例在B/x組中為26.2％(22/84)。發(fā)現(xiàn)了3個KIR2DS4新基因。(4)

12、研究KIR基因?qū)?5例進(jìn)行HSCT預(yù)后的影響，60例移植供受者均為HLA-A、B、C、DRB1、DQB1位點(diǎn)高分辨全相合，15例有單個HLA-C等位基因分型不相合。存在“缺失配體”模式的移植在A/A組和B/x組中所占的比例分別為88.6％和87.5％。采用多因素分析研究“缺失配體”模式移植的比例對移植預(yù)后的影響沒有發(fā)現(xiàn)統(tǒng)計學(xué)差異。75例移植中，當(dāng)供者KIR分型為B/x(n=40)時，移植后總體生存率(Overall survival，O

13、S)要明顯高于供者為A/A組(n=35)(RR3.1[95％ CI1.1-8.6]，P=0.007)。在其中35例供者為KIR單體型A/A純合的移植中，當(dāng)供者2DS4等位基因為完整型(n=14)時，移植后急性GVHD的發(fā)生率要明顯高于供者2DS4等位基因為缺失型(n=21)的情況(RR9.0[95％ CI1.2-66.9]，P=0.010)，其中以Ⅲ-Ⅳ度aGVHD尤為明顯(P=0.006)。Real-time PCR動態(tài)隨訪患者移植后

14、2DL1、2DS1、3DL1和3DS1基因mRNA表達(dá)水平發(fā)現(xiàn)：發(fā)生aGVHD的患者組在移植后30-90天，2DL1和3DL1和的mRNA拷貝數(shù)相比無aGVHD組明顯升高(P值分別為0.021和0.005)；當(dāng)供者與受者均為KIR單體型A純合時，這一差異更為顯著：在發(fā)生aGVHD的患者組與不發(fā)生aGVHD的患者組之間，比較移植后90天時KIR2DL1和3DL1基因的mRNA表達(dá)水平，具有統(tǒng)計學(xué)上的差異(z=2.558，P=0.011)。

15、結(jié)果提示，移植早期(<90天)KIR2DL1和3DL1基因的mRNA高表達(dá)與aGVHD的發(fā)生呈正相關(guān)。
　　 結(jié)論：中國漢族人群在KIR基因及2DS4等位基因分布上具有獨(dú)特性；供者為KIR單體型(B/x)的移植預(yù)后較好；供者來源完整型2DS4等位基因以及患者移植早期2DL1和3DL1基因mRNA高表達(dá)增加了移植后aGVHD的發(fā)生風(fēng)險。因此，移植前在HLA分型的基礎(chǔ)上結(jié)合KIR基因分型和KIR2DS4等位基因分型，可能對臨床上選擇