電針足三里對大鼠缺血再灌注損傷心肌的保護作用.pdf

1、心肌缺血再灌注（ischemia/reperfusionI/R）損傷是一種多因素參與的復(fù)雜病理過程，涉及到多個環(huán)節(jié)。目前認為，心肌I/R損傷是炎癥反應(yīng)過度表達，系統(tǒng)炎癥反應(yīng)和局部炎癥反應(yīng)共同參與的結(jié)果，由白細胞（中性粒細胞為主）和細胞因子、趨化因子激活為主的炎癥反應(yīng)在心肌缺血階段即被激活，再灌注則顯著加劇心肌的炎癥級聯(lián)反應(yīng)。因此防治心肌I/R損傷的有效辦法除了盡快恢復(fù)心肌血流的再灌注外，如何拮抗炎癥的過度表達在心肌中的損傷作用，適時保護

2、心肌是我們目前研究的主要方向。研究表明，刺激外周迷走神經(jīng)及應(yīng)用膽堿能遞質(zhì)乙酰膽堿或擬膽堿藥物煙堿能抑制內(nèi)毒素血癥導(dǎo)致的全身炎癥反應(yīng)綜合征，顯著降低細胞因子如TNF-α、IL-1β、IL-6、IL-8等的釋放，同時不影響抑炎因子IL-10的釋放，并將之命名為“膽堿能抗炎通路”（thecholinergicanti-inflammatorypathway，CAP）。心肌缺血再灌注損傷與內(nèi)毒素血癥、低血容量失血性休克均有相同病理機制，即由許多

3、炎癥介質(zhì)參與、機體失控性過度的炎癥反應(yīng)的病理過程，同時基于傳出迷走神經(jīng)電刺激對上述動物模型均具有抗過度炎癥以及器官保護的研究結(jié)果，我們假設(shè)采取任何措施興奮迷走神經(jīng)傳出纖維，都有可能激活該通路達到治療心肌I/R損傷?，F(xiàn)有資料表明，針刺足三里能夠興奮迷走神經(jīng)中樞，并增加其傳出纖維的電活動，而有關(guān)電針足三里對大鼠缺血再灌注損傷心肌的影響和機制研究目前尚未有人報道，因此本實驗擬通過電針足三里，研究該方法對I/R損傷心肌是否也具有保護作用。

4、 目的：通過運用電針足三里刺激或迷走神經(jīng)電刺激研究興奮膽堿能抗炎通路對大鼠缺血再灌注損傷心肌的保護作用，探討其作用機制。 方法：雄性SD大鼠100只，隨機分為5組：①手術(shù)對照組（SHAM組）②心肌缺血再灌注組（IR組）③迷走神經(jīng)刺激組（STM組）④電針足三里組（ZSL組）⑤非經(jīng)非穴組（FJFX組），除SHAM組外，各組均行心肌缺血30min再灌注，STM組于再灌前后各10min，共20min，以5V、2ms、1HZ強度持續(xù)刺激

5、左頸迷走神經(jīng)，ZSL組于再灌前后各15min，共30min，行電針足三里刺激，F(xiàn)JFX組于再灌前后各15min，共30min，行電針非經(jīng)非穴刺激。記錄心律失常發(fā)生率，心率（heartrate，HR），平均動脈壓（meanarterialpressure，MAP）變化；再灌注120min后，處死動物，采集標本。常規(guī)方法石蠟切片行蘇木素一伊紅（HematoxylinandEosinStaining，HE）染色，光學(xué)顯微鏡下觀察心肌的炎癥改變

6、；伊文思藍/氯化三苯基四唑（Evan'sBlue/2，3，5-Triphenyl-2H-Tetrazoliumchloride，EB/TTC）測定心肌梗死面積與免疫比濁法測定血漿肌鈣蛋白Ⅰ濃度；酶聯(lián)免疫吸附試驗（enzyme-linkedimmunosorbentassay，ELISA）檢測心肌和血漿中腫瘤壞死因子（tumornecrosisfactor，TNF）含量和白介素-6（interleukin-6，IL-6）含量；分光光度法測

7、定心肌組織髓過氧化物酶（MyeloperoxidasMPO）活性；硫代巴比妥酸法測定心肌組織丙二醛（MalondialdehydeMDA）含量；免疫組化分析心肌核轉(zhuǎn)錄因子p65（nulearfactor-kappaBp65NF-κBp65）表達；原位末端標記法（TUNEL）檢測心肌細胞凋亡。 結(jié)果：1.血流動力學(xué)和心律失常觀察：除SHAM組外，再灌120min后各組心率，平均動脈壓較缺血前均有下降（p<0.05），各組之間MAP

8、差異無統(tǒng)計學(xué)意義（p>0.05）。STM組、ZSL組心率在刺激階段有下降，STM組下降較ZSL組更明顯，但波動幅度仍在10％以內(nèi)，刺激停止后，心率回升。STM組、ZSL組再灌后心律失常發(fā)生率明顯低于IR組，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05）； 2、組織形態(tài)學(xué)觀察：光鏡下發(fā)現(xiàn)SHAM組心肌結(jié)構(gòu)正常，細胞排列緊密、界限清楚，無水腫，無炎性細胞浸潤；IR組、FJFX組心肌排列稀疏，不規(guī)則，細胞水腫，部分細胞出現(xiàn)明顯空泡變性、心肌纖維斷

9、裂，細胞間隙明顯增寬，大量炎性細胞浸潤；STM組、ZSL組心肌細胞排列較規(guī)則，細胞輕度水腫，細胞間隙增寬，炎性細胞散在浸潤； 3、心肌損傷程度觀察：各組心肌行EB/TTC染色顯示，各組間缺血范圍差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），與IR組相比，STM組和ZSL組心肌梗死范圍差異有統(tǒng)計學(xué)意義（p<0.05），心肌梗死范圍減小，而ZSL組和STM組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），F(xiàn)JFX組和IR組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）

10、，各組心肌肌鈣蛋白（cTnI）在心肌缺血前無明顯差別，再灌注120min后，除SHAM組外，其他各組cTnI較缺血前均有不同程度的升高（P<0.05），STM組和ZSL組cTnI濃度低于IR組（P<0.05），STM組和ZSL組比較，無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05）； 4、炎性標志物和氧化損害程度觀察：與SHAM組相比，各組MPO活性和MDA含量顯著增高，以IR組升高更為顯著（P<0.01），與ZSL組和STM組相比，差異也有統(tǒng)計學(xué)

11、意義（P<0.05），心肌組織和血漿中的TNF及IL-6的濃度在IR組、STM組、ZSL組、FJFX組明顯升高，與SHAM組相比差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；其中IR組升高更為顯著，與ZSL組相比，差異也有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）；STM組與ZSL組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。免疫組化檢測NF-κBp65表達，IR組大部分心肌細胞中，細胞漿染色呈陽性，細胞核染色呈陽性，ZSL組和STM組心肌細胞的胞漿呈弱陽性或陽性，細

12、胞核染色呈弱陽性，核移位細胞數(shù)目減少。平均光密度值比較發(fā)現(xiàn)STM組、ZSL組NF-κBp65表達低于IR組（P<0.05）； 5、細胞凋亡觀察：TUNEL法檢測細胞凋亡發(fā)現(xiàn)，在SHAM組中，未發(fā)現(xiàn)TUNEL陽性細胞，相反，在IR組中，呈現(xiàn)大量TUNEL陽性細胞核呈棕黃色反應(yīng)，核內(nèi)染色質(zhì)濃縮，形成密集顆粒位于核膜下，有的胞核被降解，胞漿不著色。ZSL組、STM組可見散在的陽性細胞。凋亡指數(shù)（apoptosisindexAI）比較發(fā)