HGF對PDGF-BB作用下大鼠原代HSC增殖和凋亡的作用及機制研究.pdf

1、研究背景：肝纖維化及其終末期疾病肝硬化是影響人類健康的主要問題之一，其中，慢性肝臟損傷是纖維化的主要病因。肝纖維化是一個進展性的病理過程，肝星狀細胞(hepatic stellate cell，HSC)在損傷修復(fù)時轉(zhuǎn)化為肌成纖維細胞，產(chǎn)生一系列膠原替代肝臟正常組織結(jié)構(gòu)。最近研究發(fā)現(xiàn)這一過程是可逆的，HSC的自發(fā)凋亡在肝纖維化的消退過程中具有重要意義。許多研究已經(jīng)證實了HGF的抗肝纖維化作用，但是其具體機理尚未完全明了。本實驗以SD大鼠原

2、代HSC培養(yǎng)后傳代的細胞作為研究對象，血小板衍生生長因子(platelet-derived growthfactor BB，PDGF-BB)作為促肝纖維化的對照處理，肝細胞生長因子(hepatocyte growth factor，HGF)干預(yù)處理，從HSC增殖和凋亡兩方面探討HGF抗肝纖維化的機制。 方法： 1．采用改良的膠原酶-鏈霉蛋白酶消化法分離大鼠HSC，結(jié)蛋白免疫細胞化學(xué)染色鑒定分離的HSC。 2．MT

3、T 法篩選HGF(0.5、1、2、5μg/ml)和PDGF-BB(2、5、10、20、40ng/ml)對傳代培養(yǎng)HSC的最佳作用濃度和作用時間(12、24和48小時)。 3．實驗分組：正常對照組、PDGF-BB處理組、PDGF-BB+HGF(0.5、1、2、5μg/ml)處理組和HGF處理組。MMT法觀察HGF對HSC的增殖影響以及對PDGF-BB促HSC增殖的影響。 4．實驗分組：正常對照組、PDGF-BB+HGF處理

4、組和HGF處理組。采用AO/EB染色、TUNEL和ANNEXIN V FITC/PI雙染檢測各實驗組HSC凋亡情況。采用免疫細胞化學(xué)檢測P65表達情況，電泳變動遷移率檢測作用12小時HSC中NF-κB DNA蛋白結(jié)合活性。 結(jié)果： 1．原代分離的HSC得率為2-5×10<'7>/每只大鼠，純度大于98％，存活率大于90％。 2．HGF處理組：5μg/mlHGF對HSC增殖的抑制率為41％：PDGF-BB+HGF處

5、理組：0.5、1、2、5μg/ml 4個濃度的HGF均能抑制HSC增殖，隨HGF處理濃度增加HSC增殖抑制程度增加，PDGF-BB+0.5μg/mlHGF處理與PDGF-BB處理組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，PDGF-BB+2μg/ml和PDGF-BB+5μg/mlHGF處理組之間無統(tǒng)計學(xué)差異，其他組兩兩之間均有統(tǒng)計學(xué)差異。HGF對PDGF-BB誘導(dǎo)的HSC增殖的最佳抑制濃度為2μg/ml，其抑制率為53.6％。 3．AO/EB染色、AN

6、NEXIN V FITC/PI雙染和TUNEL檢測均顯示正常組、HGF+PDGF-BB處理組和HGF處理組HSC凋亡率依次增加(P<0.05)。 4．正常組、PDGF-BB+HGF處理組和HGF處理組NF-κB DNA-蛋白結(jié)合活性依次減弱(P<0.05)。正常組P65主要胞核表達，PDGF-BB+HGF處理組和HGF處理組胞核表達較正常組減少，表達的強度也依次減弱(P<0.05)。 結(jié)論： 1、原代分離的大鼠H

7、SC經(jīng)過鑒定具有活化HSC的生物學(xué)特性，是體外研究HSC的重要模型。 2、HGF 通過c-Met受體直接作用于HSC抑制其增殖，通過阻斷PDGF-BB誘導(dǎo)HSC增殖而提高HGF對HSC的增殖抑制作用，這種雙重抑制HSC增殖的效應(yīng)可能是HGF抗纖維化的重要機制之一。 3、HGF 直接誘導(dǎo)活化的HSC凋亡，在PDGF-BB存在的條件下同樣誘導(dǎo)HSC凋亡，這是其抗肝纖維化的機制之二。 4、HGF誘導(dǎo)HSC凋亡伴有NF-