重組人抗幽門螺桿菌尿素酶B亞單位sIgA分子的構建表達及特性研究.pdf

1、幽門螺桿菌(Helicobactet pylori,Hp)為一種革蘭陰性細菌，是人類慢性活動性胃炎和消化潰瘍的重要原因，被確認是胃癌和胃淋巴樣組織淋巴瘤的危險因子。Hp感染與社會經濟狀況密切相關，在許多發(fā)展中國家其感染率超過50％，在發(fā)達國家達40％。Hp感染后若不采取特殊治療措施常常為終身帶菌。由于胃內的高酸性對抗生素有較大影響，所以，這些抗生素往往要與質子泵抑制劑和雷尼替丁枸櫞酸鉍同時使用。雖然組合抗生素方法對于治療Hp感染是有效的

2、，但是研制一種有效的疫苗將會更有益處，特別是在胃癌發(fā)病率高、感染復發(fā)率大和抗生素耐藥性不斷增高的國家。實驗證明疫苗療法對于Hp感染動物模型是相當成功的，然而在此基礎上研制一種人類預防或治療性疫苗仍然是非常困難的。采用眾多候選疫苗進行的大量臨床試驗表明其效力較差。人類在通過口服抗體治療和預防Hp方面也進行了許多嘗試，實驗證明口服抗尿素酶IgA單克隆抗體可保護小鼠不受貓胃螺桿菌(Helicobacter felis)感染。另有實驗證實sIg

3、A在兒童期防止消化道Hp感染中起著重要的作用，母乳中的IgA被攝入后能在消化道粘膜表面清除外來微生物或隨食物吞咽下的抗原。Tharas在岡比亞的研究發(fā)現(xiàn)，生后第一年未感染幽門螺桿菌的嬰兒的母乳其特異性sIgA滴度較感染嬰兒的母乳中高2～4倍，表明了母乳通過抗體依賴機制在防止幽門螺桿菌感染上起重要作用，尤其是Hp感染的母親其高濃度的特異性sIgA能大大延遲嬰兒的幽門螺桿菌感染，而第二年以后的感染可能與母嬰的密切接觸以及斷乳有關。以上實驗說

4、明特異性抗Hp sIgA在預防和治療Hp感染方面具有重要作用。然而，單克隆抗體為鼠源且不能大規(guī)模生產，而從母乳中提取足量的slgA分子也不現(xiàn)實。所以，有必要通過抗體工程技術獲得大量特異性針對Hp的sIgA分子。1994年，Michette et al.首次利用純化的Hp尿素酶作為抗原免疫小鼠，顯示對貓螺桿菌(Hf)感染有良好的保護作用，分別口服Hp尿素酶(全部結構)或其A亞單位、B亞單位，再加上霍亂毒素(CT)作為佐劑，結果證明了起保護

5、作用的是B亞單位(UreB)。另有許多實驗證明，Hp UreB能夠作為口服疫苗用于預防和治療Hp感染。所以，我們決定構建抗Hp UreB sIgA分子。主要研究結果如下： 1．抗Hp噬菌體單鏈抗體庫的構建和篩選 首先檢測獻血員抗Hp和rUreB抗體，分離陽性者外周血淋巴細胞，提取總RNA并等量混合。利用RT-PCR擴增全套重鏈可變區(qū)(VH)和輕鏈可變區(qū)(VL)基因，分子量分別約為400bp和350bp。將VH和VL純化后

6、采用overlap方法連接，插入噬菌體載體pComb3x構建成庫容量為4.6×10<'8>的單鏈抗體噬菌體庫。以純化rUreB為靶標包被96孔板，用3％BSA封閉液封閉，加入噬菌體孵育后，用洗脫液沖洗5次進行篩選。之后的篩選逐漸降低rUreB包被濃度，并增加沖洗次數(shù)。在5輪篩選之后，獲得與rUreB發(fā)生反應的41個克隆，最強的克隆命名為scFv1，通過免疫印跡的方法證明，scFv1僅與rUreB和Hp菌株反應，不與非Hp菌株反應，因此，

7、將scFv1送出測序。 2．表達載體pcDNA3.1(+)：HSVHCα<,1>和pcDNA3.1(+)：LSVLCλ<,2>的構建 首先分離人外周血中性粒細胞并提取RNA，采用RT-PCR的方法獲得人IgA1重鏈恒定區(qū)(Cα<,1>)基因，該片段分別含有EcoRI和XbaⅠ酶切位點。重鏈信號肽編碼序列是通過引物之間重疊延伸的方法獲得的。該序列與VH片段的連接采用overlap的方法，連接物含有HindⅢ和EcoRI酶切

8、位點。表達載體pcDNA3.1(+)：HSVHCα1是通過三個部分連接而成：(i)經HindⅢ/XbaⅠ酶切的質粒pcDNA3.1(+)，(ii)經HindⅢ/EcoRI處理的重鏈信號肽編碼序列與VH片段的連接物，(iii)經EcoRI/XbaⅠ消化的Cal基因。輕鏈恒定區(qū)(CX2)編碼序列是從人脾細胞基因組DNA通過PCR獲得的，該片段含有EcoRI和NotⅠ酶切位點。輕鏈信號肽編碼序列的獲得采用與重鏈信號肽相同的方法。該序列與VL片

9、段的連接同樣采用overlap的方法，連接物引入HindⅢ和EcoRI兩個酶切位點。表達載體pcDNA3.1(+)：LSVLCλ2同樣由三部分裝配而成：(i)經HindⅢ/NotⅠ酶切的質粒pcDNA3.1(+)，(ii)經HindⅢ/EcoRI處理的輕鏈信號肽編碼序列與VL片段的連接物，(iii)經EcoRI/NotⅠ消化的Cλ2基因。 3．表達載體pcDNA3.1(+)Hyg：J Chain和pcDNA3.1(-)Bsd：S

10、C的構建 首先用SmaⅠ和Bpul4Ⅰ處理質粒pcDNA3.1(+)以切除neoR抗性基因。hygR抗性基因是以質粒pMEP4(Invitrogen)為模板通過PCR的方法獲得的，分子量大約為1.1kb，并且含有SmaⅠ和Bpul4Ⅰ酶切位點。用SmaⅠ和Bpul4Ⅰ酶切PCR產物后，與切除neoR抗性基因的pcDNA3.1(+)連接產生質粒pcDNA3.1(+)Hyg。人J鏈編碼序列是以人脾細胞RNA為模板通過RT-PCR獲得

11、的，分子量大約為430bp，含有HindⅢ和NotⅠ酶切位點。用HindⅢ和NotⅠ處理RT-PCR產物和pcDNA3.1(+)Hyg后，將二者相連形成表達載體pcDNA3.1(+)Hyg：Jchain。分泌片(Secretory component，SC)的編碼序列是采用RT-PCR方法從人結腸腺癌HT29細胞中獲得的，含有HindⅢ和XbaⅠ兩個酶切位點。用HindⅢ和XbaⅠ處理RT-PCR產物和質粒pcDNA3.1(-)Bsd，

12、然后將二者相連形成表達載體pcDNA3.1(-)Bsd：SC。 4．穩(wěn)定表達特異性針對Hp UreB sIgA的CHO細胞的篩選 首先用含有小牛血清、Hepes(pH 7.0)、青霉素和鏈霉素的IMDM培養(yǎng)CHO細胞。對1×10<'7>CHO細胞進行電穿孔，用ScaⅠ-線性化的pcDNA3.1(+)：HSVHCα1和BglⅡ-線性化的pcDNA3.1(+)：LSVLCλ2轉染CHO細胞。24 h后用500 μg/ml

13、 G418開始篩選，連續(xù)進行3周。挑取單克隆于96孔板，dot-ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清。對表達最大量IgA1的克隆(Clonel)進行擴大培養(yǎng)，用BglⅡ-線性化的pcDNA3.1(+)Hyg：Jchain進行電轉染。在500μg/ml G418和400μg/ml潮霉素同時存在的條件下篩選，從而獲得了表達最大量dlgA的克隆(Clone 2)。對1×10<'7>CHO細胞進行電穿孔，然后用Bglμ-線性化的pcDNA3.1(-)B

14、sd：SC進行轉染。24 h后用10μg/ml殺稻瘟菌素開始篩選，連續(xù)進行3周。挑取單克隆于96孔板，dot-ELISA法檢測細胞培養(yǎng)上清，獲得表達最大量dIgA的克隆(Clone 3)。將Clone 2和Clone 3細胞培養(yǎng)上清濃縮，37℃作用2h。這樣，通過dIgA和SC結合我們得到sIgA分子。sIgA的特異性通過免疫印跡的方法證明，sIgA僅與rUreB和Hp菌株反應，不與非Hp菌株反應。另外Hp菌株與sIgA作用后，其粘附胃