耐亞胺培南銅綠假單胞菌耐藥機(jī)制與金屬酶、整合子的關(guān)系研究.pdf

1、銅綠假單胞菌(pseudomonas aeruginosa，PA)廣泛存在于自然界，也是臨床上重要的條件致病菌，在引起院內(nèi)感染的病原菌分離率中位居前列，且經(jīng)常檢出多重耐藥株。亞胺培南是迄今為止開發(fā)的抗菌藥物中抗菌譜最廣、抗菌作用最強(qiáng)的一類碳青霉烯類抗生素，大多數(shù)革蘭陰性桿菌都對(duì)其敏感，隨著碳青霉烯類藥物使用的越來(lái)越廣泛，細(xì)菌對(duì)其耐藥的情況也逐年增多，耐亞胺培南的耐藥株往往導(dǎo)致在臨床上無(wú)藥可治的地步。產(chǎn)金屬酶(Metallo-β-Lact

2、amases， MBL)是細(xì)菌耐碳青霉烯類抗生素主要機(jī)制之一，MBL基因可以位于整合子上，通過(guò)質(zhì)粒、轉(zhuǎn)座子的移動(dòng)在同種和不同種類的細(xì)菌間傳播。MBL中臨床最常見的是IMP-1和1VIM-2亞型，整合子中臨床最常見的是第一類整合子。本研究的目的是探討耐亞胺培南PA臨床分離株中MBL，的攜帶情況及在耐藥中的作用，研究第一類整合子在產(chǎn)MBL銅綠假單胞菌中的分布以及基因盒的攜帶情況，為細(xì)菌耐藥傳播的研究學(xué)提供流行病學(xué)基礎(chǔ)資料。 本研究收

3、集了72株臨床分離的PA，分離科室最多的前三位是： ICU病房、呼吸科和外科，對(duì)AMK的耐藥率最低，為31.9％。其中61株對(duì)亞胺培南耐藥，耐藥率為84.7％。采用瓊脂平板對(duì)倍稀釋法對(duì)其中的耐亞胺培南的42株P(guān)A做藥敏實(shí)驗(yàn)。發(fā)現(xiàn)耐藥率由低到高的分別為：AMK(31.O％)、CAZ(38.1％)、CIP(47.6％)、PIP(64.3％)。接著將這42株菌做平板CAZ-MPE紙片協(xié)同實(shí)驗(yàn)，CAZ和MPE紙片圓心距離為1.O～2.5cm，兩

4、個(gè)CAZ紙片間圓心距離為4.5cm。觀查兩者抑菌圈靠近處有無(wú)直徑擴(kuò)大的協(xié)同現(xiàn)象：陽(yáng)性結(jié)果的有27株，共7種表型，為首次對(duì)協(xié)同現(xiàn)象的結(jié)果進(jìn)行細(xì)致分型。對(duì)所有菌株進(jìn)行MBL基因IMP-1和VIM的PCR檢測(cè)，VIM的陽(yáng)性株進(jìn)一步進(jìn)行VIM-1以及VIM-2基因的PCR檢測(cè)。72株P(guān)A中發(fā)現(xiàn)55株攜帶有VIM型MBL基因，攜帶率為76％，進(jìn)一步的亞型檢測(cè)中未發(fā)現(xiàn)VIM-1型基因，只發(fā)現(xiàn)一株攜帶VIM-2基因。這55株查出攜帶VIM基因的PA中

5、有53株P(guān)A對(duì)亞胺培南耐藥，2株對(duì)亞胺培南敏感，可見含有.MBL基因未必就表達(dá)為耐藥。11株對(duì)亞胺培南耐藥的PA未查見含有MBL基因，推斷是因?yàn)槟蛠啺放嗄线€可以通過(guò)其它耐藥機(jī)制來(lái)表達(dá)，比如OprD蛋白的缺失、外排泵的高度表達(dá)等。這55株之外的一株檢出攜帶IMP-1型MBL基因。對(duì)于耐亞胺培南的61株P(guān)A，MBL基因攜帶率則為87％。紙片協(xié)同實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果的27株中，一株檢出攜帶IMP-1型基因，一株檢出攜帶VIM-2型基因，其余的25株的

6、VIM基因PCR檢測(cè)都是陽(yáng)性結(jié)果。 本研究為首次在中國(guó)西南地區(qū)發(fā)現(xiàn)IMP-1型MBL基因。PA9917的IMP-L 基因PCR檢測(cè)為陽(yáng)性，PCR產(chǎn)物測(cè)序得906個(gè)堿基，在GenBank上比對(duì)與產(chǎn)IMP-1酶PA的編碼基因(注冊(cè)號(hào)：AY251052.1)同源性為100％，即可確認(rèn)為工MP-1金屬酶基因。經(jīng)PCR檢測(cè)和測(cè)序比對(duì)，確認(rèn)含有第一類整合酶基因(與DQ219465.1的含有第一類整合子PA同源性為100％)以及約1800bp

7、大小的第一類整合子基因盒。但是第一類整合子的基因盒測(cè)序結(jié)果未見MBL基因；GenBank上比對(duì)與多種細(xì)菌包括：肺炎克雷伯菌、枸櫞酸桿菌、大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、粘質(zhì)沙雷菌、沙門菌亞屬菌均為100&同源，包含有aadA2基因，它編碼二氫葉酸還原酶，鏈霉素/大觀霉素3’磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶。說(shuō)明不同菌屬的菌株可含有完全相同的整合子基因盒。與PA(注冊(cè)號(hào)：ABl91047.1)同源性為99％，它也含有二氫葉酸還原酶，鏈霉素/大觀霉素 3’磷酸腺苷

8、轉(zhuǎn)移酶的基因，在ABl91047.1的859位為 G，對(duì)應(yīng)氨基酸為L(zhǎng)(亮氨酸)；而本實(shí)驗(yàn)所測(cè)為A，對(duì)應(yīng)氨基酸為F(苯丙氨酸)。由于所在的開放讀碼框編碼的是未知功能的蛋白，所以此突變是否有意義仍未知，有待進(jìn)一步研究。PA 9917提取質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)為陽(yáng)性結(jié)果，但是進(jìn)行質(zhì)粒的IMP-1 基因PCR檢查結(jié)果為陰性，推斷可能是因?yàn)镮MP-1基因位于染色體上。本研究也是首次在中國(guó)西南地區(qū)發(fā)現(xiàn)VIM型MBL基因。PA 895攜帶VIM基因，經(jīng)VIM-2基

9、因PCR檢測(cè)為陽(yáng)性結(jié)果，產(chǎn)物純化后測(cè)序網(wǎng)上比對(duì)，與注冊(cè)號(hào)DQ522236.1的銅綠假單胞菌同源性為100％，確認(rèn)PA 895產(chǎn)VIM-2型MBL。但是第一類整合子PCR檢測(cè)、質(zhì)粒提取實(shí)驗(yàn)均為陰性結(jié)果。質(zhì)粒提取為陰性結(jié)果，可能是VIM-2基因所在的質(zhì)粒太大沒有提取出來(lái)，也可能是本次檢測(cè)出的VIM-2基因不在質(zhì)粒上，在染色體上。 PA 9917和PA 895都對(duì)亞胺培南耐藥；CAZ和2-MPE的紙片協(xié)同實(shí)驗(yàn)結(jié)果都是陽(yáng)性；瓊脂平板對(duì)倍

10、稀釋藥敏實(shí)驗(yàn)都是除了對(duì)環(huán)丙沙星敏感外，其余都耐藥的高耐菌株。PA 9917對(duì)亞胺培南的MIC為32μg/mL，PA 895則高達(dá)512μg/mL，而亞胺培南耐藥的標(biāo)準(zhǔn)是MIC大于8μg/mL；對(duì)于頭孢他啶的MIC分別為64u g/mL和128μg/mL，皆為高度耐藥。 本研究為首次對(duì)耐亞胺培南且產(chǎn)MBL的PA中第一類整合子及基因盒的攜帶情況作一調(diào)查。56株MBL基因PCR陽(yáng)性PA中，26株攜帶有第一類整合酶基因，所以第一類整合子

11、的檢出率為46.4％。在這26株中又只有18株含有第一類整合子基因盒，第一類整合子陽(yáng)性株中基因盒的攜帶率為69.2％(18株/26株)，基因盒擴(kuò)增產(chǎn)物可根據(jù)電泳圖譜分為5種型別。55株為VIM陽(yáng)性株，其中25株檢出含有第一類整合子，這25株P(guān)A中又只有17株含有第一類整合子基因盒；1株產(chǎn)IMP-1的PA含有第一類整合酶基因與第一類整合子基因盒。它的IntIl整合酶基因PCR產(chǎn)物純化測(cè)序得906個(gè)核苷酸，在GenBarlk上進(jìn)行比對(duì)，與含

12、有第一類整合子的PA基因(注冊(cè)號(hào)：DQ219465.1)同源性為100％。接著進(jìn)行第一類整合子基因盒擴(kuò)增產(chǎn)物的測(cè)序，得1836個(gè)核苷酸，比對(duì)與肺炎克雷伯菌(注冊(cè)號(hào)：AY7484-53.1)100％同源，包含有aadA2基因，它編碼二氫葉酸還原酶，鏈霉素／大觀霉素3’磷酸腺苷轉(zhuǎn)移酶。但是GenBank上比對(duì)與PA(注冊(cè)號(hào)： ABl91047.1)同源性為99％，在ABl91047.1的859位為G，對(duì)應(yīng)氨基酸為L(zhǎng)(亮氨酸)；而本實(shí)驗(yàn)所測(cè)為

13、A，對(duì)應(yīng)氨基酸為F(苯丙氨酸)。由于所在的開放讀碼框編碼的是未知功能的蛋白，所以此突變是否有意義仍未知，有待進(jìn)一步研究。 發(fā)現(xiàn)一種突變的第一類整合子基因盒：耐亞胺培南且紙片協(xié)同實(shí)驗(yàn)陰性的PA 9576的第一類整合酶PCR檢測(cè)為陽(yáng)性結(jié)果，接著進(jìn)行第一類整合子基因盒的檢測(cè)發(fā)現(xiàn)：與第一類整合子基因(注冊(cè)號(hào)為 ABl89979.1，PA)同源性為98％，含有二氫葉酸還原酶、aadA5基因，突變堿基對(duì)應(yīng)的基因功能為編碼二氫葉酸還原酶。6個(gè)

14、氨基酸突變位點(diǎn)如下：101(D-N)、117(T-S)、118(V-G)、120(V-D)、121(E-K)、122(V-L)，突變的意義未知，有可能影響葉酸代謝從而影響細(xì)菌核酸和蛋白質(zhì)的合成；又因?yàn)榛前奉愃幬锏淖饔脵C(jī)制就是作為二氫葉酸還原酶的競(jìng)爭(zhēng)性抑制劑，所以推斷突變與磺胺耐藥有關(guān)，而細(xì)菌對(duì)磺胺的耐藥性一旦產(chǎn)生就往往是永久性、不可逆的。 本實(shí)驗(yàn)結(jié)果高度提示產(chǎn)PA產(chǎn)MBL和對(duì)IMP耐藥關(guān)系密切，協(xié)同實(shí)驗(yàn)陽(yáng)性結(jié)果高度提示菌株產(chǎn)金屬