基于人工miRNA技術(shù)篩選抗登革病毒和乙型肝炎病毒靶標(biāo).pdf

1、目的:本課題利用人工miRNA(artificial miRNA，amiRNA)技術(shù)分別從靶向病毒尋找抗登革病毒靶點(diǎn)和靶向宿主篩選抗乙型肝炎病毒宿主靶標(biāo)兩個(gè)方面進(jìn)行探索研究。
　　方法:1.病毒靶向篩選抗登革病毒靶點(diǎn):(1)構(gòu)建人工miRNA表達(dá)載體，慢病毒表達(dá)載體;(2)觀察感染登革病毒細(xì)胞的病變情況;(3) CCK-8法檢測細(xì)胞的生存率;(4)間接免疫熒光法檢測登革病毒包膜E蛋白的表達(dá);(5)蝕斑試驗(yàn)檢測細(xì)胞感染上清登革病毒的

2、滴度;(6)半定量RT-PCR法檢測細(xì)胞內(nèi)登革病毒和干擾素相關(guān)基因mRNA的表達(dá)。2.宿主靶向篩選抗乙型肝炎病毒宿主靶標(biāo):(1)構(gòu)建人工miRNA慢病毒表達(dá)載體;(2) ELISA法分別檢測培養(yǎng)上清HBsAg和HBeAg的表達(dá);(3)熒光定量PCR法檢測培養(yǎng)上清HBVDNA的表達(dá);(4)嘌呤霉素篩選AFP-amiRNA穩(wěn)轉(zhuǎn)HepG2細(xì)胞;(5)RT-PCR法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞內(nèi)AFP mRNA的表達(dá);(6)間接免疫熒光法檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞AFP蛋白

3、的表達(dá);(7) ELISA法定量檢測穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞上清AFP蛋白含量。
　　結(jié)果:1.病毒靶向篩選抗登革病毒靶點(diǎn):針對登革病毒保守區(qū)設(shè)計(jì)amiRNA，根據(jù)細(xì)胞病變情況初篩得到對感染DENV-2的細(xì)胞有保護(hù)作用的6條amiRNA，其中DENV-128組細(xì)胞生存率為90％，是DENV組的1.8倍，病毒包膜E蛋白的表達(dá)也大大降低;選用抗病毒效果顯著的DENV-128與其余5條有效amiRNA兩兩串聯(lián)后通過細(xì)胞病變情況觀察、CCK-8檢測、細(xì)胞

4、間接免疫熒光實(shí)驗(yàn)篩選得到效果明顯的串聯(lián)序列DENV128-1382，其細(xì)胞生存率為98％，是DENV組的1.6倍，病毒包膜E蛋白的表達(dá)降低;進(jìn)一步構(gòu)建并包裝表達(dá)DENV-128、DENV128-1382的慢病毒載體，通過CCK-8法檢測細(xì)胞存活率、間接免疫熒光法檢測病毒包膜E蛋白的表達(dá)情況、半定量RT-PCR檢測DENV mRNA含量、蝕斑試驗(yàn)檢測感染上清液的病毒滴度、干擾素反應(yīng)檢測amiRNA是否激活內(nèi)源性干擾素反應(yīng)等實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了ami

5、RNA對登革病毒復(fù)制的特異性抑制效果。2.宿主靶向篩選抗乙型肝炎病毒宿主靶標(biāo):針對可能與HBV感染復(fù)制相關(guān)的33個(gè)宿主分子設(shè)計(jì)amiRNA，采用amiRNA慢病毒表達(dá)載體與HBV表達(dá)載體瞬時(shí)共轉(zhuǎn)染HepG2肝癌細(xì)胞，以細(xì)胞上清HBsAg和HBeAg表達(dá)水平作為評價(jià)指標(biāo)篩選得到3個(gè)宿主分子（作用效率＞30％）;選擇甲胎蛋白基因(AFP)進(jìn)行深入研究，針對AFP設(shè)計(jì)5條amiRNA，經(jīng)HBsAg、 HBeAg和HBV DNA檢測結(jié)果得到瞬時(shí)

6、轉(zhuǎn)染對HBV復(fù)制抑制率較高的AFP-559和AFP-1621兩條amiRNA序列，其中AFP-559對HBsAg表達(dá)抑制率為59％(96h)，對HBeAg表達(dá)抑制率為44％(96h)，對HBV DNA抑制率達(dá)40％，AFP-1621對HBsAg表達(dá)抑制率為49％(96h)，對HBeAg表達(dá)抑制率為33％(96h)，對HBV DNA抑制率達(dá)37％;然后通過包裝慢病毒建立了AFP的穩(wěn)定沉默HepG2細(xì)胞，RT-PCR、細(xì)胞間接免疫熒光及AF

7、P蛋白定量實(shí)驗(yàn)顯示AFP的mRNA與蛋白表達(dá)均被顯著抑制，證明穩(wěn)轉(zhuǎn)細(xì)胞構(gòu)建成功。
　　結(jié)論:1.針對登革病毒保守區(qū)篩選到包括DENV128在內(nèi)的6條有效amiRNA和1種amiRNA有效組合DENV128-1382，證實(shí)DENV-128和DENV128-1382能有效抑制登革病毒的復(fù)制并提高細(xì)胞存活率。2.篩選到潛在抗HBV的宿主靶標(biāo)3個(gè)，并初步驗(yàn)證了AFP靶點(diǎn)的有效性;基于amiRNA技術(shù)成功建立了AFP穩(wěn)定沉默的HepG2細(xì)胞