胃食管反流通過NFκB介導(dǎo)的炎癥破壞小鼠食管粘膜屏障功能.pdf

1、研究背景和目的:食管上皮屏障功能是食管粘膜對抗胃食管反流的重要防御機(jī)制。胃食管反流可誘導(dǎo)食管上皮屏障功能的損傷，食管粘膜對特定離子以及大分子通透性的增強(qiáng)以及上皮細(xì)胞間隙的增寬。因此，理解反流誘導(dǎo)的食管粘膜屏障功能損傷的機(jī)制對尋求胃食管反流病的有效干預(yù)措施具有重要的臨床意義。Barrett食管是胃食管反流病的繼發(fā)病變之一，但胃食管反流進(jìn)展為Barrett食管的分子機(jī)制至今還不清楚。本研究的目的：1）探討NFκB介導(dǎo)的炎癥在胃食管反流誘導(dǎo)食

2、管粘膜屏障功能損傷中的作用;2）探討胃食管反流病進(jìn)展為Barrett食管的分子機(jī)制。
　　研究方法:建立手術(shù)誘導(dǎo)的胃反流，十二指腸反流和胃十二指腸混合反流的小鼠模型.使用mini-Ussing chamber檢測各反流食管粘膜跨上皮電阻抗值，利用電鏡觀察并比較各型反流食管粘膜上皮間隙的改變。應(yīng)用基因芯片技術(shù)檢測各型反流食管粘膜上皮內(nèi)特異的基因表達(dá)譜，再利用生物信息學(xué)分析策略（例如GSEA和SAM）篩選出表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)的轉(zhuǎn)錄因子，

3、激活的經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路以及具有相似功能的基因簇，同時也篩選出基因組內(nèi)所有表達(dá)上調(diào)或者下調(diào)的基因。采用Real-time PCR，免疫印跡，ELISA和免疫組化方法檢測篩選基因的表達(dá)水平。使用特殊組織化學(xué)染色來顯示各型反流食管粘膜內(nèi)炎癥細(xì)胞的分布，并對炎癥細(xì)胞的數(shù)量進(jìn)行統(tǒng)計比較。分別給予十二指腸反流和混合反流模型小鼠腹腔注射NFκB抑制劑Bay11-7085(20mg/kg/day)，觀察食管粘膜跨上皮電阻抗以及炎癥因子水平的改變。

4、>　　研究結(jié)果:與正常小鼠食管粘膜上皮比較，十二指腸反流和混合反流食管粘膜的跨上皮電阻抗明顯下降，但胃反流粘膜并未有明顯改變。電鏡觀察到十二指腸反流和混合反流食管粘膜上皮細(xì)胞間隙明顯增寬，而胃反流食管粘膜間隙并未明顯改變。GSEA分析表明，在各型反流食管粘膜中有大量炎癥相關(guān)基因簇和經(jīng)典信號傳導(dǎo)通路被激活，同時在十二指腸反流和混合反流食管粘膜上皮中可見NFκ表達(dá)上調(diào)。通過將SAM數(shù)據(jù)與已知NFκB下游基因、緊密連接蛋白基因以及Barret

5、t食管相關(guān)基因進(jìn)行比對，篩選出一系列上調(diào)或者下調(diào)的NFκB下游基因、緊密連接蛋白基因以及Barrett食管相關(guān)基因。Real-timePCR顯示在十二指腸反流和混合反流食管粘膜上皮中緊密連接蛋白Cldn1，Cldn4，Cldn10和Cldn23的表達(dá)均下調(diào)，同時Cldn7的表達(dá)上調(diào)。免疫印跡和免疫組化顯示在十二指腸反流和混合反流食管粘膜中Cldn1和Cldn4蛋白表達(dá)水平明顯下調(diào)并且在食管上皮內(nèi)的分布發(fā)生了明顯改變。免疫組化顯示NFκB

6、亞基p50和p65，NFκB下游基因MMP3和MMP9以及Cdx2在十二指腸反流和混合反流食管粘膜上皮中的表達(dá)均明顯上調(diào)。十二指腸反流和混合反流食管粘膜中炎癥因子水平以及炎癥細(xì)胞計數(shù)均明顯增加。NFκB抑制劑Bay11-7085可以明顯減弱反流對食管屏障功能的損害并且抑制反流誘導(dǎo)食管粘膜炎癥因子水平的上調(diào)。
　　研究結(jié)論:1）胃食管反流通過NFκB介導(dǎo)的炎癥損傷小鼠食管上皮屏障功能;2)胃食管反流通過激活Barrett相關(guān)基因的表